新型抗酸胁迫元器件的高效筛选及其普适性作用机制解析

The acid accumulation caused by carbon metabolism is the key factor to reduce physiological activity of microorganisms. However, at present, it is still short of efficient screening and targeting control strategies based on the analysis of regulatory mechanism of anti-acid components. In this study, Lactococcus lactis NZ9000 is used as the type strain, and novel anti-acid components with typical function will be screened according to previous physiological regulation and omics data. Meanwhile, assembly solutions with different anti-acid components will be chosen after their interaction evaluation. After the genome-scale metabolic regulation model reconstruction, the flux balance analysis will be applied to predict the effect of anti-acid components on cell's physiological performances. In this case, the optimal solution will be used to construct mutant strains. With the physiological comparison between the parent and mutant strains, ideal anti-acid components with significant effect against acid stress and little perturbation on metabolism will be confirmed. On this basis, the universality of these anti-acid components will be studied further combined with physiological differences between different strains. Moreover，this study will lay a solid theoretical foundation to strengthen the anti-acid performance of industrial microorganisms.

碳代谢导致的产酸积累是促使微生物细胞活性降低的关键因素，但目前尚缺乏基于对抗酸元器件生理调控机制解析的高效筛选及靶向控制策略。本项目以乳酸乳球菌NZ9000为模式菌株，在整合前期研究中抗酸胁迫生理调控及组学数据的基础上，筛选具有典型作用机制的新型抗酸元器件，并通过对元器件间的互作关系分析，确定协同作用的抗酸元器件装配方案。通过基因组代谢调控模型优化，应用流量平衡分析对抗酸元器件作用下的细胞生理特性进行效能预测，并根据最终拟合的抗酸元器件装配方案对原始菌株进行分子改造，构建抗酸胁迫预测突变株。通过原始菌株与突变株细胞生理活性的考察，验证并确定具有显著抗酸效果且对菌体自身代谢微扰动的抗酸元器件及其组装模块。在此基础上，结合菌株间的细胞生理学差异，解析抗酸元器件在不同微生物种群间的普适性作用机制，为工业微生物家族成员抗酸胁迫生理功能的强化奠定坚实的理论基础。

碳代谢导致的产酸积累是促使微生物细胞活性降低的关键因素，但目前尚缺乏基于抗酸元器件生理调控机制解析的靶向控制策略。本项目以乳酸乳球菌模式菌(Lactococcus lactis NZ9000)为出发菌株，在整合抗酸胁迫生理调控及组学数据的基础上，筛选具有典型作用机制的新型抗酸元器件，并通过对元器件间的互作关系解析，优化协同作用下的抗酸元器件装配方案。在此基础上，结合菌株间的细胞生理学差异，考察了抗酸元器件在不同微生物种群间的普适性作用效果。主要研究结果如下：(1)以L. lactis NZ9000为出发菌株，应用高通量筛选技术获得三株耐酸性能显著提升的突变菌株。结合组学分析技术揭示了酸胁迫条件下乳酸乳球菌在转录水平上的响应机制，初步筛选了一批具有潜在作用效果的抗酸元器件； (2) 通过基因工程改造，证实了ABC转运蛋白基因(rbsA、rbsB、msmK和dppA)、氨基酸转运蛋白基因(arcB、ctrA、glnP和glnQ)、膜蛋白基因zitP和zitQ、精氨酸代谢途径ArgG和ArgH蛋白以及硫胺素代谢相关蛋白可显著提高重组菌株的酸胁迫耐受性；(3) 优化了具有潜在效果的抗酸元器件串联组装模块，串联组装效果最为显著的L. lactis (GlnP/GlnQ) 菌株存活率分别是L. lactis (GlnP)和L. lactis (GlnQ)的16.0和36.6倍。进一步研究表明，GlnP和GlnQ的串联组装通过提高胞内天冬氨酸、谷氨酸等氨基酸的浓度以及ATP水平促进细胞酸胁迫抗性的提升；(4) 在L. lactis NZ9000中过量表达了来源于E. coli MG1655和L. lactis A76的DNA同源重组蛋白RecT，可提高其酸胁迫耐受性。在此基础上，在E. coli BL21中过量表达来源于E. coli MG1655的DNA同源重组蛋白RecT可以将菌株的酸胁迫抗性提高10倍以上，从而拓展了本课题发现的元器件在不同微生物中的普适性研究。本项目筛选到的多种抗酸胁迫元器件，为工业微生物家族成员抗酸胁迫生理功能的强化和高效抗酸工业微生物优良生产菌株的构建奠定了基础。