蓝细菌光敏色素AphC的分子设计及其光形态转换机制研究

Phytochrome are a class of very important light receptors, which have the reversible photochromic character. In recent years, the magazine such as Nature had reported that many phytochromes had been used as the fluorescent probe, photosensitive original and light controlled molecular devices and so on. These phytochromes were researched clearly in their photomorphogenesis. The AphC contains 2 GAF domains which can covalently coupled with the blue pigment PCB, GAF1 and GAF3. The PCB-GAF3 had a very special characteristics of orange light - red absorption reversible changes. To study clearly the photomorphogenesis transformation process and photocatalytic dynamic of AphC, here we use the mutation methods to select the important amino acids which can impact the photomorphogenesis of AphC, then modified the amino acids to maitain the orange light absorbtion. We use Raman spectroscopy, Fourier transform infrared spectroscopy to detect the changes in the molecular structure of the pigment-protein and photosynthetic products, and analog a light form transformation process from these data. At last, we analyze the atomic energy level changes by the femtosecond time transient absorption spectroscopy with broadband detection and multicomponent global analysis, from that we can get the simulated photo dynamic. The research of photomorphogenesis conversion and photodynamic of AphC and the modification will deepen and expand the understanding the morphology and structure of the phytochrome protein. Especially it will expand the applications of AphC in biological and optogenetics, also it has important significance in its practical application.

光敏色素具有可逆光致变色的特征，是优良的光敏材料。近年来Nature等权威杂志陆续报道，将已经研究清楚的光敏色素蛋白应用于荧光探针、光控分子器件等生物与光遗传学领域。蓝细菌光敏色素AphC含有两个能够结合藻蓝色素PCB的结构域：GAF1,GAF3，特别是GAF3连接的色素蛋白具有独特的橙光-红光吸收可逆变化的特征。为了研究清楚AphC连接色素后的光形态转化机制和光催化动态，运用突变的方法筛选出影响AphC光形态变化的功能氨基酸，并通过氨基酸设计使其橙光吸收状态更稳定；运用拉曼光谱、傅立叶红外光谱测定色素蛋白分子结构变化和光合产物，模拟出光形态转化过程；运用飞秒时间光谱测定飞秒级时间内原子能级变化，并应用其宽波段检测和多元整体分析，模拟出光动态。对AphC色素蛋白的突变设计以及光形态转化的研究将加深对重要蓝细菌光敏色素蛋白形态结构的认识，扩展其在生物和光遗传学上的应用。

蓝细菌光敏色素是一类优良的光敏材料，因具有可逆光致变色的特征，可使用不同波长光来调控其形态。近年来被广泛应用于荧光探针、光控分子器件等生物与光遗传学领域。蓝细菌光敏色素AphC含有两个能够结合藻蓝色素PCB的结构域：GAF1,GAF3，均可连接的色素PCB形成可逆光形态变化，特别是GAF3更具有独特的橙光—红光吸收可逆变化的特征。运用随机诱变的方法构建了AphC的诱变体库，筛选与光形态转换有关的氨基酸突变体，目前已有十余个随机诱变体，在进行光谱测定中；再通过同源比对确定保守性氨基酸，设计了十余个突变位点，已得到部分突变体的克隆，与藻蓝色素PCB结合后测定光谱，发现GAF1中有两位点的氨基酸，分别是51位R, 139位H与光转换相关，其中139位H突变为Y后，色素蛋白基本丧失了光转换的功能，初步判断为影响AphC光形态变化的功能氨基酸；而GAF3中也筛选出1位氨基酸，突变后能其橙光吸收状态更稳定。后期将会对这些蛋白进行拉曼光谱、NMR光谱测定色素蛋白分子结构变化和光合产物，模拟出光形态转化过程；并运用飞秒时间光谱测定飞秒级时间内原子能级变化，并应用其宽波段检测和多元整体分析，模拟出光动态，从而为光敏色素蛋白AphC的应用奠定基础。此外，研究了自然界中产纤维素酶的特性。从自然界筛选到的产纤维素酶菌株J1-3-1具有良好的产酶和酶分解活性，经16sRNA鉴定为鞘氨醇杆菌属。针对鞘氨醇杆菌生理特性，从温度和pH范围等外界条件对该菌株进行适应和驯化实验。温度实验表明，J1-3-1在30℃-35℃温度环境下适应状况较好，产酶活性也较高，其中35℃最适合该菌株的生长，经驯化后能在43℃以下生存并产酶；温度恒定35℃，pH改变的环境中，该菌株在pH为5.0-7.5的条件下，生长良好且稳定，产酶活性较好，其中以pH7.0时酶活性最高，可以判断该菌株在pH7.0时生长状况最佳。酸性环境影响该菌株的生长，产酶活性不高，而碱性环境则对其影响不大，在pH8.0时生长状况较好，酶活性稍下降。