米根霉α-淀粉酶高麦芽糖生成能力的关键蛋白结构研究

Fungal α-amylase is a key enzyme in the production of high maltose syrup, its high maltose-forming ability is an important catalytic feature and industrial application property, but this function related protein structure is not clear. The project intends to use Rhizopus oryzae α-amylase as the study object, and the maltose-forming ability related candidate amino acids of the enzyme will be obtained through bioinformatic analysis of the primary and tertiary structure of the enzyme. The mutation of specific site amino acids will be performed by single point mutation and combination of multilocus mutagenesis. The key amino acids and protein structural features that related to the maltose-forming ability of the mutants will be obtained by analyzing the tertiary structure model, products composition, substrate specificity and kinetic parameters. The research results may provide a new strategy for studying the high maltose-forming ability of fungal α-amylase, and provide a new theoretical basis for the restructuring and directed evolution of fungal α-amylase.

真菌α-淀粉酶是高麦芽糖浆生产过程的关键酶制剂，高麦芽糖生成能力是其重要的催化特征与工业应用属性，但与该能力相关的酶蛋白结构特征不明。本项目拟以米根霉来源的真菌α-淀粉酶为研究对象，使用生物信息学分析方法对该酶进行一级结构比对和三级结构模拟，获得影响麦芽糖生成能力的候选氨基酸；利用单位点突变和多位点组合突变技术对特定位点的氨基酸进行突变；通过对特定突变体的三级结构模型、水解产物组成、酶促动力学参数与底物催化特异性等进行研究与分析，获得与突变体麦芽糖生成能力相关的关键氨基酸并建模解析其蛋白结构特征。研究结果可为真菌α-淀粉酶高麦芽糖生成能力这一关键催化功能的研究提供新的策略，为真菌α-淀粉酶的重组及其功能的定向进化提供新的理论基础。

为在分子水平上研究米根霉α-淀粉酶高麦芽糖生成能力相关的关键氨基酸与蛋白结构特征，本项目在执行过程中主要完成了如下工作。. 基于分子对接模拟结果，对米根霉α-淀粉酶保守区域内保守氨基酸以及底物结合区域关键氨基酸或亚位点氨基酸进行了定点突变、组合突变以及定点饱和突变研究，并对突变体进行了基本理化性质和结构建模分析，初步获得了与高麦芽糖生成能力相关的主要蛋白结构特征和催化机制。结果表明：突变体麦芽糖生成能力与突变体作用麦芽三糖时的底物亲和常数直接相关；突变体作用淀粉时麦芽糖的生成能力与作用麦芽三糖时的麦芽糖生成能力直接相关；突变体的麦芽糖生成能力与酶的可溶性淀粉亲和力之间可能没有之间关联关系。分子对接模拟显示突变体对麦芽三糖底物具有选择性氢键作用的变化机制可能是突变体具有更高麦芽糖生成能力的主要原因之一。此外，突变体与底物的非还原端-1位之间的氢键和非极性作用强度的增加而引起的酶催化机制的变化可能是突变体具有不同麦芽糖生成能力的另一个主要原因。研究结果为真菌α-淀粉酶高麦芽糖生成能力的定向进化奠定了理论基础和技术参考。. 基于酶蛋白B-factor分析和分子动力学模拟，通过蛋白分子理性设计对米根霉α-淀粉酶热稳定性进行了定向进化，所得组合突变体G128L/K269L/G393P在55 ℃下的热失活半衰期约为原酶的5.63倍；结构建模分析表明突变体蛋白质微观结构的调整和其他氨基酸之间新的氢键的形成、疏水性氨基酸对局部蛋白质结构的稳定作用以及在柔性结构中利用刚性氨基酸（Pro）替代柔性氨基酸（Gly）而提高蛋白质局部区域刚性作用均可能是各类突变体热稳定性得到显著增强的主要原因。研究结果可为真菌α-淀粉酶的酶功能改性提供理论参考。