免疫性血小板减少症（ITP）中VH替换与抗血小板抗体的研究

One of the hallmark of primary immune thrombocytopenia (ITP) is the production of anti-platelet antibody; however,the underlying mechnism is unclear. VH replacement is the secondary rearrangement of Immunologbulin heavy chain (IgH) gene, which provides exata positively charged amino acids into the CDR3 regions of IgH. In the preliminary data, we found the B cell receptor (BCR) of ITP Naive B cells preferencially reacted with platelet antigens, indicating a defective central immune tolerance for B cells to platelets. Interestingly, most of these anti-platelet BCRs or previously studied anti-platelet antibodies were translated from VH replacement products. Based on these, we hypothesize that excessive VH replacements contribute to production of antibodies against the negative charge-rich platelet glycoproteins, such as GPIIbIIIa. We will investigate this hypothesis with comprehesive methods including single cell PCR for cloning antibody, BCR high through-put sequencing, ligation PCR, bioinformatic analysis, and immunoglobulin gene modification. We expect that the central tolerance for B cells in ITP patients is defective, and excessive VH replacements contribute to the generation of anti-platelet antibodies in ITP patients. Understanding the mechanisms responsible for the generation of anti-platelet antibodies will allow us to design specific approaches for ITP diagnosis and new targets for ITP treatment.

免疫性血小板减少症(ITP)最重要的病理特征之一是产生抗血小板自身抗体，但这些抗体产生的原因尚不明确。VH替换是免疫球蛋白重链基因的二次重排，能够向抗体互补决定区3（CDR3）中提供多余的正电荷氨基酸。我们的前期工作提示ITP患者存在中枢免疫耐受缺陷，并且大部分识别血小板抗原的B细胞受体（BCR）或抗血小板抗体由VH替换产物翻译。因此我们推断：VH替换能促进抗体与富集负电荷的血小板糖蛋白（如GPIIbIIIa）结合，是抗血小板抗体产生的主要来源。本项目中我们将利用单细胞PCR制作抗体、BCR高通量测序、L-PCR技术、生物信息学分析、抗体基因修饰等方法，进一步证明ITP患者存在中枢免疫耐受缺陷且VH替换发生率升高，并证明VH替换对于抗血小板抗体生成有决定性作用。这一假说的成功验证将为ITP诊断提供新的标志物，并为ITP治疗提供新的靶点。

原发性免疫性血小板减少症（ITP）的特征在于抗血小板抗体的过量产生，但目前这些抗血小板抗体产生的机制仍不清楚。受体编辑是中枢B细胞耐受的主要机制，可以增加免疫球蛋白（Ig）可变片段-连接片段（V-J）距离。课题开始，我们对Ig基因进行了第二代测序，发现ITP外周B细胞的IgK链的V-J距离减小，提示受体编辑减少。此后我们对ITP患者外周幼稚B细胞（CD19 + IgM + CD27-CD10-）进行了单细胞测序，测序结果证实了这种现象。我们进而表达出来源于这些单个幼稚B细胞的重组单克隆抗体，并测试它们的血小板反应性。结果发现抗血小板幼稚B细胞在ITP患者中蓄积，占总幼稚B细胞的14.53％，而健康供者中这一比例仅为1.94％。在抗血小板抗体中，大多数与糖蛋白GPIIb/IIIa或其他多种抗原交叉反应。序列分析发现，抗血小板B细胞在Ig重链互补决定区3中使用较多带正电荷的氨基酸，有利于与富集负电荷的糖蛋白结合。这些数据表明ITP与中枢B细胞耐受缺陷相关，该缺陷可能是Ig基因中受体编辑不足的结果。本研究首次发现了ITP发病的新机制，并为ITP治疗提供了新的靶点，即通过干预B细胞免疫检查点治疗ITP。此外，本研究为ITP研究开辟了新的研究方向：我们将继续使用类似的方法来研究其他的B细胞亚群（如浆母细胞，浆细胞，IgG记忆细胞，IgM记忆细胞，B1细胞等），以深入了解ITP患者中抗血小板B细胞的产生和选择的机制。目前项目资助发表SCI文章1篇；核心内容已投稿《Blood》杂志，目前审稿中。参加国际会议报告2次，国内报告多次。培养硕士生毕业1名，在读博士生1名。