米根霉产L-乳酸途径丙酮酸分支点MCA研究

L-乳酸是天然有机酸，目前作为酸味剂、乳化剂、保鲜剂等广泛应用于食品工业。本研究针对米根霉发酵产高光学纯度L-乳酸中存在副产物高，糖酸转化率低，菌种退化严重等问题，采用代谢控制分析（MCA）与基因工程等技术，最大限度阻断米根霉糖代谢副产物形成，提高乳酸转化率。通过对米根霉碳代谢中丙酮酸节点关键分支酶ADH、LDH、PC、PDC的分离纯化及特性研究，建立分支酶胞内调控模式；通过丙酮酸分支点碳代谢流量分配及调控机理研究，获得各分支酶的物流控制系数（FCC）。以具有最大FCC的分支酶为靶位，研究激活剂或抑制剂对其代谢调控作用；采用分子生物学手段依次定向突变最大FCC分支酶，从而获得L-乳酸转化率显著提高的米根霉菌株。研究结果可为米根霉代谢调控系统的建立、高产菌株的选育、发酵条件的优化提供理论支持，亦为不同微生物的碳代谢调控提供参考。

L-乳酸是天然有机酸，作为酸味剂、乳化剂、保鲜剂等广泛应用于食品工业。本研究针对米根霉发酵产L-乳酸中存在副产物高，糖酸转化率低等问题，采用代谢控制分析（MCA）技术，研究米根霉碳代谢中丙酮酸节点关键分支酶ADH、LDH、PC、PDC对碳代谢调控特性及调控机理，获得各分支酶的物流控制系数（FCC），并研究激活剂或抑制剂对其代谢调控作用。研究以期为米根霉代谢调控系统的建立、发酵条件的优化提供理论支持。研究主要结论如下：.（1）通过相关性分析和程度控制系数的计算，米根霉碳代谢分支点处PC与PDH、LDH与PDC、ADH与PDC、LDH之间均呈显著相关性（P<0.01），PDC对丙酮酸稳态通量起负控制作用。对L-乳酸通量，正控制程度依次是PDH、PC和LDH，ADH呈负控制；对乙醇通量，PDH和ADH的控制作用最强，PC起强负控制作用；对乙酰辅酶A通量， PDH和PC起主要正控制作用；对草酰乙酸通量， PDH和PC的控制作用最强，ADH的负控制能力也很强。拟合稳态通量与丙酮酸分支酶酶活性的曲线，计算丙酮酸分支酶对系统的FCCs值可知，代谢稳定期时施加控制能力的是PDC和PC。综合丙酮酸各分支酶的FCCs，认为PC是主要控制米根霉发酵产L-乳酸丙酮酸分支点代谢途径的关键分支酶。.（2）分别利用氧化磷酸化抑制剂鱼藤酮和菌种诱变选育降低胞内ATP水平，发现低浓度的ATP有利于解除高能荷水平对糖酵解关键酶活性抑制作用，使磷酸果糖激酶（PFK）、己糖激酶（HK）、丙酮酸激酶（PK）活性均得到提高，糖酵解速度和丙酮酸转化率提升。同时丙酮酸分支点乙醇脱氢酶（ADH）的活性下降，乳酸脱氢酶（LDH）活性升高，最终导致L-乳酸的产量提高，乙醇产量下降。.（3）通过改变碳源组成、改变溶氧量、添加烟酸三种策略调节胞内NADH/NAD+比例发现，随着NADH/NAD+比率下降，ATP含量呈现一定比例的下降，有利于糖酵解关键酶磷酸果糖激酶（PFK）、己糖激酶（HK）、丙酮酸激酶（PK）及丙酮酸分支酶LDH活性的提高和ADH活性的下降，最终导致主要代谢产物L-乳酸产量提高，乙醇产量下降。.（4）通过利用呼吸缺陷型菌株为实验菌株，改变碳源组成、添加NAD+前体物烟酸，使米根霉在保持较低ATP水平的条件下降低胞内NADH/NAD+比例，使目标产物L-乳酸积累量大幅度上升。