发展用于解析膜蛋白三维结构的固体NMR PRE-Rosetta方法

Solid-state NMR (SSNMR) has special advantages in structural characterization of membrane proteins which are located in native lipid-bilayer environments，and its spectral line-width is not limited by the weight of membrane proteins. As a consequence, SSNMR is regarded as a very promising analytical technique to study the three-dimensional structures of membrane proteins. However, conventional SSNMR methods basing on nuclear dipolar-dipolar couplings are so difficult to acquire adequate long-range distance restraints that their applications are limited in the aspect of structures of proteins. To overcome this limitation, the applicant developed PCS-Rosetta to determine high-resolution structure of diamagnetic proteins in solid phase by SSNMR in his Ph. D research. As one of paramagnetic labeling methods, Pseudocontact shift (PCS) can provide abundant long-range distance restraints. This research work has already been published in JACS. Based on the PCS-Rosetta method, we intend to develop a new SSNMR method basing on paramagnetic relaxation enhancement (PRE) and Rosetta, which can be called PRE-Rosetta, to facilitate the structural characterization of membrane proteins in this project. As another kind of paramagnetic labeling method, PRE can provide abundant long-range distance restraints of membrane proteins in theory. The applicant has already done some preliminary work on this project, which shows expected results. The implement of this project will be able to enhance the efficiency of SSNMR to study the structures of membrane proteins.

固体NMR在膜蛋白结构研究中具有独特优势，能在磷脂双分子层中研究膜蛋白，且分辨率不受膜蛋白分子量限制，因此被认为是研究膜蛋白三维结构非常有前景的分析技术。然而，基于自旋核间偶极-偶极耦合的常规固体NMR方法在蛋白质的三维结构解析中存在着“难以获得足够的长程距离约束”的瓶颈。针对此瓶颈，申请人在博士研究生期间发展了用于蛋白质三维结构解析的固体NMR PCS-Rosetta方法，相关工作以第一作者身份发表于JACS杂志，并获得国内外同行的好评。前期的工作基础表明，顺磁标记方法是获得蛋白质长程距离约束的有力手段，基于类似的思路，本项目拟利用顺磁弛豫增强(PRE)作用来获得膜蛋白的长程距离约束，发展适用于膜蛋白三维结构测定的固体NMR PRE-Rosetta方法。针对这个想法，申请人已开展了初步的研究工作，并已获得预期的实验结果。预期本项目的顺利实施将极大提高固体NMR解析膜蛋白三维结构的效率。

固体NMR在膜蛋白结构研究中具有独特优势，能在磷脂双分子层中研究膜蛋白，且分辨率不受膜蛋白分子量限制，因此被认为是研究膜蛋白三维结构非常有前景的分析技术。然而，基于自旋核间偶极-偶极耦合的常规固体NMR方法在蛋白质的三维结构解析中存在着“难以获得足够的长程距离约束”的瓶颈。针对此瓶颈,申请人在博士研究生期间发展了用于蛋白质三维结构解析的固体NMR PCS-Rosetta方法，并得到国际学者的认同。前期的工作基础表明，顺磁标记方法是获得蛋白质长程距离约束的有力手段，基于类似的思路，本项目中，我们利用顺磁弛豫增强(PRE)作用来获得膜蛋白的长程距离约束，发展了适用于膜蛋白三维结构测定的固体NMR PRE-CS-Rosetta方法。.膜蛋白是生物体内一类非常重要的蛋白，它参与了生物体内各种代谢活动，大量新型药物的开发和研制与膜蛋白结构密切相关。大肠杆菌中的膜蛋白-甘油二脂激酶（DAGK）是一种很重要的生物酶，它具有121个氨基酸，功能单位是三聚体，生物功能是促使甘油二脂磷酸化。它的三维结构先后被液体核磁共振和X射线晶体衍射解析出来，液体核磁解共振解析出来的DAGK结构是在去垢剂DPC胶束的环境中，而X射线晶体衍射解析出来的DAGK结构是在LCP（lipidic cubic phases）的环境中，由于两种手段解析DAGK的膜环境有较大差异，得到的两种结构也有很大差异。两者在二级结构和三维结构上都有明显的不同，研究者称两者最显著的差异是液体核磁共振的DAGK结构中含有结构域的穿插现象，而在晶体结构中没有观测到，这说明环境对膜蛋白结构的解析影响很大。DAGK的天然环境是E.coli磷脂双层膜，因此在本项目中，我们以膜蛋白DAGK为模型，发展了膜蛋白三维结构的PRE-CS-Rosetta方法，并解析得到了DAGK在E.coli磷脂双层膜中的三维结构，进而系统比较了在E.coli磷脂膜环境中DAGK结构与在去垢剂中结构的差异，解决了其结构争议。