固体核磁共振解析七次跨膜蛋白Leptosphaeria rhodopsin的三维结构

Solid state NMR is an emerging and rapidly growing technique in structure determination for membrane proteins, which has a unique advantage in studying membrane proteins after reconstitution into lipids environments. Leptoshpharia rhodopsin(LR) is a photo-sensory seven transmembrane protein, discovered in microbial eukaryote, L. maculans. It functions in utilizing light energy to transport the protons across the membrane. LR can be expressed in mice neurons, and presents a new class of powerful optical neural silencer, which can be applied in the research of neuroscientific, biological and bioengineering fields. Structure-guided mutagensis of LR may facilitate development of neural silencer with new capability. Hence, obtaining high resolution three dimensional structure of LR would be important to understand the light driven proton pump function of LR and to assist in the structure-guided mutagenesis design of LR. This proposal aims at developing new spasely isotope labeling protocols that are suitable for solid-state NMR studies on membrane proteins. With this new labeling technique, high resolution three-dimensional structure of LR in lipids is expected to be solved by solid-state NMR. The achievement would provide a general approach for determining large membrane protein structures by solid state NMR.

生物固体核磁共振是新兴的膜蛋白结构研究手段之一，其优势在于可以在生物膜环境中解析膜蛋白的结构。本课题拟应用固体核磁共振技术解析七次跨膜蛋白Leptoshpharia rhodopsin（LR）的三维结构。LR是源于真核微生物L. maculans的光敏感跨膜蛋白,其功能是利用光能实现质子的跨膜运输。近期研究表明，LR可以在小鼠神经细胞中表达，是一种新型的光控神经抑制试剂，因此可应用在神经科学、生物学、基因工程等领域的研究中。设计LR突变体，实现其不同功能，将是未来光遗传学领域研究的重要内容之一。因此，LR的三维结构对深入认识其质子跨膜运输机理和实现不同功能的LR突变体设计有重要的意义。本课题将逐步建立在真核细胞中表达制备部分同位素标记膜蛋白的新型实验方法，并结合固体核磁共振技术解析LR的三维结构。这一方法也将适用于其他大分子量膜蛋白结构的科学研究。

Leptoshpharia rhodopsin（LR）是源于真核微生物L. maculans 的光敏感七次跨膜蛋白。其功能是利用光能实现质子的跨膜运输。研究表明，LR 可以在小鼠神经细胞中表达，并在特定波长光照射下，沉默含有LR 的神经细胞，是光遗传学领域研究的重要工具蛋白。因此，深入探索LR 的结构对认识其质子运输机理和实现不同功能LR 突变体的设计有重要的意义。此项目的主要目的是解析LR在膜环境中的结构和研究其机理。在项目的资助下，课题组首次建立了毕赤酵母菌表达体系的真核七次跨膜蛋白部分13C同位素标记方法，建立了膜蛋白固体核磁共振快速采样技术，以及创新固体核磁脉冲序列设计等。利用发展的固体核磁实验方法，完成了膜环境中LR的固体核磁共振信号指认；完成了三聚态LR聚合界面的结构分析。基于H/D交换固体核磁共振实验，发现LR蛋白的疏水内部存才一个极性的亲水口袋，进而利用水编辑固体核磁实验证明了LR蛋白活性中心Schiff-base上的活泼氢和溶剂中的水存在化学交换现象，并测量了Schiff-base上的活泼氢与水的化学交换速率，为1.5 ms-1。本课题发挥了固体核磁共振在膜蛋白研究方面的独有优势，解析了嵌入磷脂中LR的结构，为深入理解ＬＲ结构和功能提供了重要的研究思路。此外，此项目的研究方法具有普适性，可以应用于其他膜蛋白和生物大分子的研究中。课题组完成了拟定的主要研究内容，部分研究成果已经在相关学术期刊发表。项目资助发表期刊论文８篇（其中SCI收录7篇），完成学术专著１篇，另有两篇学术论文待发表。在人才方面，此项目培养博士后１名，博士研究生毕业１名，在读博士9名。