从“有故无殒”理论探究自噬在雷公藤肝脏毒性中的作用及机制

Tripterygium Wilfordii Hook. f., one of the toxic herb, was focused on toxic-effect relationship and toxicity control by researchers due to its great significance in theory and application. In a previous study of the NSFC，we have discovered that autophagy involved in hepatotoxicity induced by Tripterygium Wilfordii Hook. f. and interacted with pole like kinase 1 (PLK1). We further found that inhibition of PLK1 could enhance autophagic flux. Regarding, we offered a scientific hypothesis, i.e. Cell fate determination was regulated by autophagy. Tripterygium Wilfordii Hook. f. could switch the hepatocyte fate between autophagic death and proliferation, differentiation through regulating PLK1 with autophagy proteins. According to the TCM theory of YOU GU WU YUN, not only normal mice and Concanavalin A (ConA) induced immunological liver injury mouse, but also normal hepatocyte and injured hepatocyte induced by LPS were used as the experimental materials in the presented project. Moreover, morphological methods, ProcartaPlex TM，co-immunoprecipitation (Co-IP), western blot, GFP conjugated agarose beads, tandem mass spectrometry, and bioinformatics were used to explore the effect and mechanism of autophagy in Tripterygium Wilfordii Hook. f. induced hepatotoxicity. The study could provide the scientific theoretic facts for the proper use of toxic herbs.

在上一个国家自然基金面上项目的研究中，我们发现细胞自噬介导了雷公藤诱导的肝毒性。免疫共沉淀实验结果发现，自噬体蛋白(LC3, P62和Beclin-1)与调控细胞有丝分裂的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶PLK1有较强的相互作用，而肝敲低PLK1可显著提高细胞自噬的水平。因此，我们提出细胞自噬调控肝细胞命运决定，雷公藤活性组分可能通过影响“PLK1-自噬蛋白”的交互作用调控肝细胞命运的转化(或恢复活跃的有丝分裂，或启动自噬性细胞死)的科学假说。依据中医“有故无殒”理论，本项目拟选取正常动物和ConA诱导免疫性肝损伤模型动物，及正常肝细胞和LPS诱导应激肝细胞为实验材料，从“整体”和“离体”两个研究层次，应用形态学、多细胞因子免疫芯片、免疫共沉淀、蛋白印记、GFP亲和树脂微球、串联质谱及生物信息学等技术探究自噬在雷公藤肝脏毒性中的作用和机制，为有毒中药合理使用提供理论依据和实证资料。

雷公藤及其制剂是临床常用药，因为存在肝、肾和生殖毒性，其应用和开发均受到一定的影响。依据中医“有故无殒”理论，中药的毒性和药效作用可以发生转化。为了探明“毒-效”转化的机制，本课题围绕雷公藤肝毒性及其对急性肝炎模型的干预作用，展开了系统研究。在研究过程中，我们解析了雷公藤毒/效二重性的可能分子过程，发现了雷公藤甲素（雷公藤红素）影响细胞命运决定的关键“开关”（即通过影响P62-PLK1蛋白相互作用而实现“正-负”双向调节）。.这一发现把细胞增殖（PLK1是细胞有丝分裂调控的关键激酶）与细胞自噬性凋亡的相互调控关系联系在一起，为揭示有毒中药免疫抑制、抗肿瘤、抗炎作用提供了新研究角度。.我们确证了雷公藤甲素是细胞自噬的诱导剂，其可能的机制是促进PLK-1与自噬蛋白LC3、P62的结合，同时启动溶酶体与自噬体的融合和降解，从而加速自噬流的形成；发现PLK-1的活性受翻译后修饰（磷酸化、乙酰化）的调控。.其中泛素化作用对肝细胞的功能具有不同的干预模式，在应激状态下，肝细胞泛素化水平升高；抑制泛素化后PLK-1的表达和活性会显著增强，这可能是“毒/效”转化的物质基础。.本课题的研究取得二个重要结果: 1) 细胞在生理状态和病理状态下，对各类刺激因素的应答存在不同模式，它受功能蛋白翻译后修饰的调控；2) 疾病的不同病理阶段和不同分型可能对应着关键信号通路上蛋白分子差异性翻译后修饰模式，这就为理解中药多靶点、复杂效应，以及同病异治、异病同治的科学内涵提供了新的思考角度。.本项目的研究为阐释中医“有故无殒”思想提供了实证资料，促进中西医结合学科的知识融通发展。