血管生长素调控内质网应激在动脉粥样硬化中的机制研究

Atherosclerosis is the main pathological basis of coronary heart disease (CHD), and endoplasmic reticulum (ER) stress plays critical roles in the progression of atherosclerosis. We previously found that angiogenin (ANG), as a stress-activated ribonuclease, was elevated in CHD patients, while knockout of ANG aggravated vascular ER stress and promoted the progression of atherosclerosis in ApoE-/- mice. In kidney injury, ANG-mediated tiRNA reduced ER stress and improved kidney injury by inhibiting eIF4F and promoting stress granule assembly. It is reasonable to hypothesize that ANG might be an important regulator of ER stress in atherosclerosis. And in this project, ApoE-/- mice and ANG-/-/ApoE-/- mice models of atherosclerosis and HUVEC model of ER stress will be established to elucidate the regulating mechanisms of ANG-mediated tiRNA on ER stress through eIF4F/stress granule pathways and to illuminate the roles of ANG on endothelial dysfunction and atherosclerosis. Ultimately, we intend to provide a new idea for the prevention and treatment of atherosclerosis.

动脉粥样硬化是冠心病的主要病理基础，内质网应激在动脉粥样硬化中发挥重要作用。申请人前期研究发现一种应激活化的核糖核酸酶-血管生长素（ANG）在冠心病患者血浆中显著升高，而全身敲除ANG可加重ApoE-/-小鼠血管内质网应激并促进动脉粥样硬化形成。在肾损伤中，ANG通过tiRNA抑制eIF4F并促进应激颗粒形成而降低内质网应激，进而改善肾损伤。本项目从动脉粥样硬化内质网应激调控角度出发，提出“ANG是动脉粥样硬化中内质网应激重要调控分子”的科学假说，拟通过ApoE-/-小鼠和ANG-/-/ApoE-/-双基因敲除小鼠动脉粥样硬化和内皮细胞内质网应激模型及相关机制研究，探讨ANG通过tiRNA介导的eIF4F/应激颗粒途径抑制蛋白质翻译，降低内质网应激，进而改善血管内皮功能，阻断动脉粥样硬化进展。本研究将阐明ANG对内质网应激调控机制及其在动脉粥样硬化中的作用，为动脉粥样硬化防治提供新思路。

背景：内质网应激通过促进内皮细胞凋亡和炎症导致动脉粥样硬化发展。血管生长素（ANG）可调节内质网应激。冠心病患者的血浆ANG水平明显高于健康对照组。本研究旨在探究ANG在动脉粥样硬化进展中的作用与机制。方法：由于ANG是一种信号肽依赖的分泌蛋白，我们构建了ANG全肽（ANG-FL）和去信号肽（ANG-ΔSP）过表达腺相关病毒分别使细胞外和细胞内ANG过表达，并尾静脉注射至ApoE-/-小鼠，同时构建ANG和ApoE双全身性基因敲除小鼠（ANG-/-/ApoE-/-）和内皮细胞ANG条件性敲除ApoE-/-小鼠（ANGfl/flTie2cre/+/ApoE-/-）及其同窝阴性小鼠（ANGfl/fl/ApoE-/-）、ANG-FL和ANG-ΔSP过表达HUVECs稳转株和ANG敲低的HUVECs稳转株，评估内质网应激和黏附分子水平、巨噬细胞浸润和动脉粥样硬化程度。同时，通过对ANG敲除小鼠RNA测序技术筛选下游靶基因并进行功能验证。结果：分析GSE100927和GSE43292数据集发现人动脉粥样硬化斑块中ANG的表达降低，这和在不同周龄ApoE-/-小鼠主动脉中发现的ANG表达变化是一致的。与空载体组和ANG-FL过表达组相比，ANG-ΔSP过表达在体内和体外均明显下调内质网应激和黏附分子表达水平，并减轻ApoE-/-小鼠巨噬细胞浸润程度和动脉粥样硬化斑块面积。内皮细胞特异性ANG敲除在体内和体外均明显上调内质网应激和黏附分子表达水平，并加重ApoE-/-小鼠巨噬细胞浸润程度和促进动脉粥样硬化斑块进展，上述结果可被内质网应激抑制剂4-PBA逆转。对ApoE-/-、ANG-/-/ApoE-/-、ANGfl/fl/ ApoE-/-和ANGfl/flTie2cre/+/ApoE-/-小鼠的RNA测序显示ST3 β-半乳糖苷α-2,3-唾液酸转移酶5(ST3GAL5)的表达呈ANG依赖性，并且ANG-ΔSP过表达载体对oxLDL诱导的HUVECs的内质网应激水平和黏附能力的抑制作用被转染的ST3GAL5小干扰RNA逆转，通过染色质免疫沉淀技术测序和双荧光素酶报告基因实验发现ANG直接调控ST3GAL5的转录。结论：这些结果表明，内皮细胞内ANG通过调控ST3GAL5表达进而抑制内质网应激，从而减轻动脉粥样硬化进展，为临床开发新靶点以治疗动脉粥样硬化提供理论基础。