浙江常用中药圆锥铁线莲多酚氧化酶响应紫外诱导催化香豆素生物合成的机制研究

Clematis terniflora DC. is one of the important medical resources with anti-tumor effect in the north of Zhejiang province. However, the low content of active ingredients hinders the process of utilization on this plant. Funded by the National natural science foundation, the UV-B irradiation technology was performed that induced the production of coumarins in leaves of Clematis terniflora DC. Parts of these coumarin have significant anti-tumor activity. Based on metabolomic analysis, more metabolites which may be involved in coumarin formation were identified and two biosynthetic pathways of coumarins were predicted. Furthermore, it was proved that polyphenol oxidase (PPO) is the key enzyme of coumarin (esculetin) biosynthesis in Clematis terniflora DC..In order to explore the inherent mechanism of coumarin biosynthesis, virus induced gene silencing and metabolomic technologies will be used to reveal the catalyzation mechanism of PPO in esculetin formation. The transcription regulatory mechanism of PPO expression will be analyzed by qRT-PCR technology. This study will reveal the biosynthetic mechanism of coumarins, accelerate the research progress of active components in medical plants, and promote the biotransformation of active ingredient in Traditional Chinese Medicine.

圆锥铁线莲是浙北地区常用抗肿瘤中药材，疗效肯定，但有效成分含量低限制了其进一步利用和开发。在国家自然科学基金资助下，我们应用紫外诱导技术，使圆锥铁线莲叶片产生了具有显著抗肿瘤活性的香豆素类化合物。通过代谢组学研究，进而又发现了多个结构近似的香豆素类化合物，并预测了两条香豆素生物合成途径。实验也证明多酚氧化酶（PPO）是圆锥铁线莲中香豆素（七叶亭）合成的关键酶。.为深入研究香豆素的生物合成机理，我们拟利用基因沉默技术，结合代谢组学研究，揭示多酚氧化酶催化七叶亭生物合成的作用机制，并使用QRT-PCR技术分析PPO诱导表达的转录调控机制。该研究将有助于阐明香豆素的生物合成途径，加快药用植物活性成分生物合成机理的研究进程，并促进重要中药活性成分的生物转化研究。

中药有效成分含量普遍不高是制约中药应用发展的瓶颈之一。香豆素多具有抗氧化、 抗艾滋病、抗肿瘤和抗菌等生物活性，是中药新药和创新药物先导化合物的重要来源。但是香豆素在植物中的生物合成途径至今未被明确阐释，阻碍了香豆素化合物的进一步运用和发展。圆锥铁线莲是浙北地区常用抗肿瘤中药材，应用紫外诱导技术使圆锥铁线莲叶片产生了具有显著抗肿瘤活性的香豆素类化合物，实验证明多酚氧化酶（PPO）是圆锥铁线莲中香豆素（七叶亭）合成的关键酶。.本项目构建了圆锥铁线莲VIGS_PPO突变体，利用蛋白质组学和代谢组学技术进一步研究了PPO在紫外诱导胁迫下的功能机制。通过激素调控实验和转录因子分析研究了紫外诱导下PPO表达及香豆素生物合成的信号转导及调控机制。通过对异戊烯基转移酶的序列分析及异源表达实验验证了CtPT1的功能作用。以上实验证明PPO显著影响了圆锥铁线莲叶绿素合成和光合作用及糖酵解过程。诱导后，UVR8初始信号进一步激活了JA和SA信号通路，JA信号通路通过GABA shunt途径增强了氮源到碳源的转化，从而为积累次生代谢物提供碳骨架结构；转录因子分析证明WRKY家族成员可能直接对香豆素途径合成基因进行了转录调控；而CtPT基因的异源表达实验证明其发挥了圆锥铁线莲诱导胁迫下吡喃香豆素生物合成的关键异戊烯基化催化作用。.通过本项目研究，圆锥铁线莲响应紫外诱导的香豆素生物合成过程及调控机制基本趋于清晰，研究结果将加快药用植物活性成分生物合成机理的研究进程，并促进重要中药活性成分的生物转化研究。