胆管癌胆汁中肿瘤相关分泌蛋白的筛选与功能分析

The early detection of cholangiocarcinoma is not easy to practice till today due to lacking of ideal early detection biomarkers. Bile is stored, concentrated and transported in the biliary system after being secreting from the hepatica and the biliary epithelial cell, so abundant bioinformation which relates to the tumorigenesis of biliary tract could be detected from it. In the prior research, we have identified several differential expressed secretory proteins such as hemopexin precursor from bile of chlolangiccarcinoma, but their biological functions related to tumor behavior such as proliferation, chemotherapy resistance, infiltration and invasion have not been established. In addition, its diagnosis significance for cholangiocarcinoma need further study to valuate. In this study, 2D-DIGE and SILAC analysis will be employed to identify differential expressed tumor-associated secretory proteins of cholangiocarcinoma via bile and CM. After that, ELISA，RIA，western-blot, immunohistochemistry and nude mouse model will be adopt to validat the differential expressed tumor-associated secretory proteins in cholangiocarcinoma. By means of these in vivo and in vitro studies, we can not only get a better understanding of tumorigenesis of cholangiocarcinoma, and can get a clue about early detection biomarkers of cholangiocarcinoma.

胆管癌早期诊断标志物的筛选问题一直是困扰临床、亟待解决的科学难题。胆汁是胆管癌细胞生长的局部微环境，肿瘤细胞在发生、发展的过程中会不断地将一些肿瘤相关分泌蛋白排泄到胆汁中，这些蛋白不仅完成了细胞内翻译后修饰的过程，而且其成分也远比组织及血清简单，故低丰度、低分子量的肿瘤标志蛋白在胆汁中更容易被筛选到。我们前期的研究也发现，胆管癌胆汁中存在以hemopexin precursor等为代表的差异表达分泌蛋白，而其与肿瘤增殖、耐药、侵袭、转移等生物学行为的关系以及是否具备潜在早诊价值还有待进一步研究。本课题拟采用2D-DIGE、SILAC等定量蛋白质组学分析方法，以ERCP微创获取的胆管癌胆汁及胆管癌细胞培养物上清为主要研究对象，通过体内外研究相对照的方式筛选并鉴定肿瘤相关分泌蛋白，在后续确证研究与功能分析的基础上进一步探讨其与胆管癌恶性生物学行为的关系，为筛选胆管癌早期诊断标志物提供新的途径。

胆管癌是一种发病隐匿、致死率高、严重威胁人类健康的胆系恶性肿瘤。在美国，65％的胆管癌患者于确诊后的一年内死亡，预后极差。流行病学资料显示，全球胆管癌的发病率近年来有快速上升的趋势，而从地域分布上来看，我国则是全球胆管癌的高发区域，防控形势异常严峻。. 因胆管癌具有沿管壁缓慢浸润生长的特性，胆管癌患者在病变早期常缺乏较为典型的临床表现，而影像学检查也很难将其与胆道结石、慢性硬化性胆管炎等良性病变相鉴别。尽管CA19-9、CEA 等血清肿瘤标志物对胆管癌的诊断与鉴别诊断具备一定的参考价值，但因敏感性与特异度相对较低，还远无法满足胆管癌早期诊断的需要。再加之人体胆管管径较细、组织菲薄且修复困难，胆道超声内镜与组织细胞学检查实施起来相当困难且风险较大，因而，临床上绝大多数胆管癌患者在确诊时已为中晚期，其5年生存率不足5%且近30年来未发生根本改变。除此以外，因胆管癌对常规的放、化疗缺乏敏感性，因而早期根治切除仍然是当前治疗胆管癌最为有效的方法，而要实现胆管癌早期根治切除率的提高，关键还是要筛选灵敏度更高、特异性较强、更能动态反映胆管癌肿瘤变化且更易于检测的早期诊断标志物。. 本课题研究，以体外培养的正常胆管上皮,胆管癌细胞培养物上清及胆管癌患者的胆汁为主要研究对象，通过应用iTRAQ定量蛋白质组分析方法，筛选胆管癌肿瘤相关分泌蛋白。通过实验研究，我们从胆管癌细胞分泌上清中筛选到778个差异表达蛋白，通过Real-time PCR分析，从26个差异表达蛋白中初步筛选了5个目标蛋白进行细胞、组织及体液水平的确证性研究。通过细胞及组织的western-blot分析及细胞爬片、组织芯片免疫组化分析以及胆汁蛋白western-blot分析，我们从中筛选出三个肿瘤相关分泌蛋白,即DNAJB1, PODXL, TPD52。通过pathway分析及生物信息学分析，进一步了解其在肿瘤发生发展中的作用以及筛选胆管癌诊断标志物奠定了基础。