大丽轮枝菌毒素蛋白编码与分泌相关基因的筛选鉴定

大丽轮枝菌可导致棉花等多种重要经济作物产生黄萎病。研究表明，大丽轮枝菌分泌物中含有的毒素蛋白是其致萎的主要活性因子，大丽轮枝菌致病力丧失的突变体，其培养物中毒蛋白的分泌也随之丧失。目前，本实验室联合深圳华大基因研究院共同完成了大丽轮枝菌VD991的全基因组测序，并采用农杆菌介导的遗传转化方法，构建了大丽轮枝菌T-DNA插入的突变体库，在此基础上，本研究拟通过筛选致病力丧失或明显下降的突变体，采用高效TAIL-PCR方法获得插入基因的侧翼序列，经过与全基因组序列比对，快速获得大量候选目的基因的全序列。然后，采用真菌的同源双交换基因定点敲除方法对目的基因的功能进行鉴定，期望获得大丽轮枝菌毒素蛋白编码基因或与其分泌相关的基因。目前，大丽轮枝菌毒素蛋白合成基因及其分泌相关基因的克隆和功能鉴定，国内外尚未见报道。本研究将填补大丽轮枝菌毒蛋白合成和分泌机制研究的空白，对阐明其致病机制具有重大意义。

大丽轮枝菌可导致棉花等多种重要经济作物产生黄萎病，研究大丽轮枝菌毒素蛋白合成基因及其分泌相关基因，对阐明其致病机制具有重大意义。本研究通过棉花幼苗接种和拟南芥平板毒素接种检测，筛选获得2个致病力下降的突变体,采用Tail-PCR方法和基因组比对分析，将上述2个突变体的T-DNA插入位点进行了定位，其插入位点基因分别为分泌途径基因VdATPase和VdSec22；通过缺失大丽轮枝菌非同源末端连接途径的关键基因Vdku80，成功构建大丽轮枝菌高效基因敲除受体菌株,大大提高了转化效率；利用上述高效基因敲除平台，构建了VdATPase和VdSec22基因定点敲除突变体,实验表明上述基因的缺失影响了菌株毒蛋白的分泌，证明这2个蛋白是大丽轮枝菌的重要分泌途径蛋白，在大丽轮枝菌诸多胞外致病蛋白的分泌和棉花致病性中起重要作用。VdATPase和VdSec22基因可作为防治棉花黄萎病的潜在的生物靶点。