红曲色素相关分泌基因的克隆与功能分析

Monascus pigment, one of the most important secondary metabolites produced by Monascus spp.，has been used for food colorant for more than thousands of years. The demand for Monascus pigment as food colorant is rapidly increased due to its natural product and safety since the safety of the synthesized pigment is questioned in recent years. However, the productivity of monascus pigment, especially that produced by liquid fermentation, is very low due to its poor water solubility and location in the intra-cellular. Thus, understanding the secretion mechanism of monascus pigment at the molecular level will contribute to improve the yields. Bioinformatics analysis show there are genes (including MpigL, MpigQ, MpigT) which involve in pigment secretion in the genome sequence of Monascus ruber.In addition, gene cluster coding for pigment synthesis have been cloned in our research group. Based on these results, markless deletion and overexpression of these genes involving in pigment secretion will be performed to construct genetically modified mutants(GMM), and the transcriptional level and protein expression of the genes involving in pigment synthesis in these GMMs will be detected. Furthermore, we will analyze the secretory mechanism of monascus pigment and construct genetically modified monascus strain with high-producing pigments. In short, all these results will provide theoretical guidance to promote the robust development of monascus pigment industry. Related researches and patents haven't been published so far.

红曲色素（Monascus pigment，MP）是红曲菌(M. spp.)的主要次生代谢产物，作为食品着色剂在我国有上千年的应用。由于合成色素的安全性受到质疑，天然、安全的MP需求旺盛，是近年来我国增长最快的食品着色剂。但是由于MP水溶性差，主要存在于胞内，从而影响MP产率，特别是液态发酵的产率。从分子水平研究MP分泌机制将有助于提高色素产率。本项目组通过分析红色红曲菌（M. ruber）M-7基因组,获得了MP基因簇以及与MP分泌相关的基因(MpigL、MpigQ和MpigT)。本研究拟采用无痕基因敲除和过表达技术，分别构建MP分泌基因的单（多）基因突变株,分析它们对MP产生及MP主要基因转录与表达的影响，探讨MP分泌的分子机制，构建具有高分泌能力的高效安全的MP工程菌。研究结果将为促进我国MP产业健康稳定发展提供理论与技术支撑。相关研究国内外均未见报道，也未见相关专利申请授权。

红曲菌是我国传统的食药两用丝状真菌。红曲菌产生的红曲色素（Monascus pigments，Mps）作为天然色素，在食品、化妆品和印染有着广泛应用。Mps是一类噬氮酮类化合物，根据颜色分为红、橙、黄三类，主要存在于菌丝体内，目前商品化Mps产品多数以液态深层发酵的菌丝体为原料，通过酒精萃取得到，存在费时费力问题和环境污染隐患。研究表明，Mps一般通过囊泡萌发、转运、锚定和融合，由囊泡运输系统分泌至胞外。因此，本研究以红色红曲菌（M. ruber）M7中Mps合成基因簇中的主动运输载体蛋白MpigP，囊泡锚定蛋白MpigL以及囊泡融合Ypt家族蛋白Ypt7的编码基因为研究对象，以M7为出发菌株，通过基因单/双敲、回补和过表达技术分别构建MpigP、MpigL和Ypt7基因的突变株，分析各突变株胞内外Mps含量变化，菌丝中囊泡和液泡数量变化，转录组分析Ypt7基因缺失突变株中ABC/MFS蛋白、Ank蛋白、囊泡转运等相关蛋白基因转录水平的变化。结果表明：.1．MpigP主要参与了黄色素胞内转运，并影响橙、红色素的合成；MpigL与携带有黄色素的Ve膜与细胞器（橙色素合成场所）膜的结合位点相关；Ypt7通过影响跨膜转运和囊泡转运相关蛋白基因和次生代谢产物合成相关基因的表达，调控Mps胞内运输和向胞外分泌，以及Mps的合成。.2．合成Mps的酶和中间产物经高尔基体分泌到细胞质中早期内涵体中，然后将酶与中间产物分别转运到黄色素、橙色素和红色素的内涵体合成相应色素：.a．黄色素存在2条分泌途径：一是由Ypt7介导囊泡运输至胞外；二是在Vps1和MpigP共同作用下，或Yps2的作用下，通过与MpigL锚定后，将黄色素和酶转运到橙色素内涵体中合成橙色素。.b．橙色素存在2条分泌途径：一是由Ypt7介导通过囊泡分泌到胞外；二是在Vps3及Vesicle membrane-SNARE蛋白作用下，识别红色素内涵体膜上的Target membrane-SNARE，形成SNARE复合体将橙色素及相关酶转运到红色素内涵体中合成红色素。.c．合成的红色素一部分由Ypt7介导囊泡分泌至胞外，一部分则留在胞质中。.本研究结果揭示了Mps部分分泌蛋白的功能以及Mps分泌合成的途径和机制，为后期提升Mps产率和制备单一性Mp提供思路和材料。