利用斑马鱼技术研究PIAS1基因的抗炎机制及在重症急性胰腺炎的作用效应

全身炎症反应综合症是重症急性胰腺炎病情进展中的关键因素，早期调控促炎症介质释放已成为疾病基础研究的热点之一。JAK/STAT信号传导途径负性调控分子PIAS1是近年来发现的一种抗炎枢纽蛋白，我们的研究率先发现抑制该信号传导途径和PIAS1 预处理均改善重症急性胰腺炎病情，然而在早期抗炎的相关机制尚未阐明。本项目利用斑马鱼胚胎通体透明，能无创性拍摄细胞行为的优势，建立巨噬细胞lyz基因启动子EGFP标记转基因斑马鱼，直观性解析PIAS1基因过表达及基因静默后对巨噬细胞迁移及ras-MAPK/ERK/JNK/P38MAPK-MMPs调节效应。构建腺病毒介导的PIAS1基因，通过分子生物学，核磁共振三维血管重建及灌注成像技术进一步评估探索PIAS1基因过表达治疗重症急性胰腺炎大鼠的作用机制及效应。此项目的完成有助于探索新型的炎症抑制靶点，并为治疗重症急性胰腺炎提供新的机制和策略。

本项目通过构建行巨噬细胞Lyz基因启动子EGFP标记的转基因斑马鱼筛选和制备和哺育，通过构建Morpholino-PIAS1测效质粒，并达到验证Morpholino-PIAS1的特异性基因沉默作用的目的；体外转录PIAS1基因的mRNA，作为过表达组以及与Morpholino共注射组，结合激光共聚焦显微镜，实验中能够实时动态观察在炎症区域完整的绿色的巨噬细胞向伤口处迁移，聚集和外渗的运动和变化。结果发现，提示PIAS1基因对巨噬细胞的活化、迁移具有抑制作用，此发生机制与PIAS1参与调控MAPK/JNK/P38MAPK-MMPs信号传导通路活化。在上述研究的基础上，本项目通过构建腺病毒Ad5/F35介导PIAS1上调重症急性胰腺炎(SAP)SD大鼠PIAS1蛋白的表达，揭示PIAS1的高表达可降低SAP时胰腺组织的炎性反应及改善肺组织急性损伤的程度，机制表现为降低疾病病程中血清中促炎症介质水平的释放如TNF-α、IL-1β 和 IL-6等，促使肺组织 MMPs、ICAM-1蛋白表达下调，RECK等蛋白升高，从而维持肺泡壁完整性，降低血气屏障通透性，改善肺损伤炎症程度,此外,研究发现在疾病进程中，RELM-α和MIZ1可能在病程中发挥作用，其水平的变化并可能成为疾病病情严重程度的判断指标之一。最终，该项目结论揭示PIAS1与巨噬细胞的迁移的负性调控关系，此不仅为阐述其抗炎症的新机制提供分子水平和细胞水平理论，更揭示PIAS1对SAP的治疗效应。