肝再生过程中肝血窦内皮细胞动态调控的信号途径及机制研究

Liver regeneration is a controllable repairing process. Liver sinusoidal endothelial cells (LSEC) plays important role in liver regeneration since they are not only the signal responsors and also the initiators of signals. They could regulate the proliferation of hepatocyte and themselves. Our previous work on the plasma membrane protein of LSEC at different stages of liver regeneration showed that, after partial hepatectomy for 36 h, 48 h and 72 h, specific receptors and Src kinase, PKA and PKC on the plasma membrane of LSEC were highly expressed alternatively, accompanied by corresponding changes in the functional proteins. Most importantly, this data is in accordance with published results, i.e., Src is contribute to the proliferation of endothelial cells whereas PKA could inactivate Src through activate the kinase of Src and promote the formation of endothelial vessel. Thus, we speculated that the alternative activation of these signal pathway might direct the progress of liver regeneration. Based on the previous data, we intend to profile the secreted proteins of endothelial progenitor cells, and compare the differentiated expressed mRNA to find out its upstream signals; then using kinase activity assay and the administration of kinase inhibitor in vivo, to investigate the relativity between certain kinase and the specific stage of liver; finally, the phosphoproteomics study of LSEC and bioinformatic analysis might clarify their downstream signaling network and target functional protein. In summary, we plan to clarify the upstream signal, middle key kinases and downstream network of LSEC at different stage of liver regeneration and investigate these signal pathways on the angiogenesis in liver regeneration. We expected that this study might provide clues for the clarification of the controllability of liver regeneration.

肝再生是可控的程序性修复过程，血窦内皮细胞既是信号的响应者，也调控自身与肝实质细胞的增殖，在肝再生中起重要作用。我们前期血窦内皮细胞质膜差异蛋白质组数据显示，肝切除不同时期内皮细胞质膜上特定受体与Src激酶、PKA及PKC依次激活，相应功能蛋白发生量的改变，与已有研究结果Src激酶主要与内皮细胞增殖相关，而PKA可通过激活Src的激酶使之失活并促进血管生成相符。为了深入研究肝再生过程中肝血窦内皮细胞动态调控的信号途径及机制，本项目拟在前期基础上，对肝切除后不同时期的内皮祖细胞进行分泌组研究，以确定血窦内皮细胞上游刺激信号的差异；同时结合免疫印迹、激酶或受体特异性抑制，确定激酶活性与肝再生特定时段的相关性；最后鉴定肝血窦内皮细胞磷酸化蛋白组，以确定关键激酶下游的功能分子靶标及相互关系。从而对肝再生过程中不同阶段肝血窦内皮细胞介导的信号通路上、中、下游与肝再生血管生成可控性的关系进行全面探讨。

肝再生是可控的程序性修复过程，血窦内皮细胞既是信号的响应者，也调控自身与肝实质细胞的增殖，在肝再生中起重要作用。本研究工作在前期工作的基础上，对肝切除后不同时期的血窦内皮祖细胞进行了定量分泌组学和差异表达谱研究，对其进行了亚细胞定位、分子功能以及参与的生物学进程进行了分析，同时也对差异表达蛋白进行了KEGG分析及验证，表明肝再生终止阶段可能通过铁死亡机制抑制肝实质细胞的增殖，实现肝脏的可控增殖。结合免疫印迹和激酶活性测定的方法，对前期鉴定到的处于血窦内皮质膜上关键激酶的量和活性进行了测定，结果表示PKC激酶的高表达在48小时，PKC激酶可能仅参与了新生血管的起始，与前期的质谱鉴定结果一致。对血窦内皮细胞与血管生成相关蛋白进行了筛选与RTPCR定量验证，同时对血窦内皮细胞转录水平及蛋白水平的表达趋势进行了比较，并对肝再生过程中微区对PAR4蛋白招募的功能进行了验证，表明PAR4蛋白在肝再生过程中极可能是通过招募定位在脂质微区从而发挥作用。同时探讨了BixFex-TiO2新型纳米功能复合材料在富集磷酸化蛋白质中的能力，并进行了肝再生过程中磷酸化蛋白质组分析，显示微区受体平台并不完全是通过招募受体蛋白通过量的积累启动信号传递，磷酸化修饰调控可能作为蛋白表达量调控的一种补充，且磷酸化蛋白的表达与蛋白激酶G（PKG）信号传导的通路相关。硝基化修饰作为一种磷酸化修饰的竞争性修饰，可能参与血窦内皮细胞的增殖抑制效应，硝基化修饰蛋白质的鉴定分析结果提示酪氨酸硝基化Hexokinase-1及PIK3C2G有可能通过影响血管的正调控以及阻滞细胞周期的进程，从而参与调控血管再生的停止。为了探究miRNA在肝再生终止期发挥何种调控作用，测定了肝再生72h的miRNA表达谱，并进行了关键miRNA的筛选和靶基因预测,同时对靶基因进行了GO/KEGG分析和PPI网络构建，构建了miRNA-mRNA调控网络，显示包括rno-miR-206-3p、rno-miR-1-3p、rno-miR-200a-3p、rno-miR-34a-5p和rno-miR-93-5p在内的5个miRNA调控了至少两个及以上与血管生成相关的Hub基因，表明这些miRNA在调控肝再生期间的血管生成发挥了重要作用，且Hif1a、Igf1、Sirt1以及Vegfa可能为参与血管生成的重要基因。