细胞压力诱导转录通读的机制和功能

Transcription is a key step in the regulation of gene expression, however its termination mechanism remains elusive. Dysfunction of transcription termination is an important feature of tumorigenesis and virus infection, but its pathological function is not yet clear. Recent studies have reported that there is large-scale abnormal transcription readthrough in cells under hyperosmotic condition, while our previous time-course GRO-seq data reveal that the transcription of many genes could not efficiently terminate after DRB treatment. Here, we propose to investigate the molecular mechanism of stress-induced transcription readthrough: apply genome-wide CRISPR/Cas9 screening to identify transcriptional termination factors; utilize quantitative mass spectrometry to detect dysfunctional transcription termination regulators under DRB and KCl stress. Meanwhile, we aim to explore the pathological functions of readthrough transcripts (RTs): employ GRID-seq technology to study the interactome between RTs and chromatin; take small RNA-seq to detect potential new miRNAs processed from those RTs, followed by dissecting their functions in cellular stress response. The results would help us better understand the mechanism of transcriptional termination dysfunction under tumorigenesis and virus infection, providing a molecular theoretical basis for effective treatment of relevant diseases.

转录是基因表达调控的关键环节，但其终止机制的研究目前并不完善。转录终止失调是细胞癌变和病毒感染过程中的重要特征，但是其病理学的功能尚不清晰。最近的研究报道，细胞在高渗条件下出现大规模的转录通读异常，我们前期DRB处理细胞后的时序GRO-seq数据揭示很多基因的转录不能正常终止。申请人拟研究压力致使转录通读的分子机制：利用全基因组范围的CRISPR/Cas9技术系统地筛选转录终止调控因子;利用定量质谱技术鉴定在DRB和KCl压力下功能失调的转录终止因子。同时，将研究通读转录本的病理学功能：运用GRID-seq研究通读转录本与染色质的互作功能；用small RNA-seq检测压力条件下通读转录本能否通过加工生成新miRNAs来行使调控功能。这将为解析细胞癌变和病毒感染过程中转录终止失调提供线索，为相关疾病的有效治疗提供分子理论基础。

在真核生物中，RNA聚合酶II（RNAPII）负责蛋白质编码基因以及许多非编码基因的转录。越来越多的证据表明，在受到外界压力时，包括热击、低氧、高渗透压和氧化压力等，基因的转录不能正常终止，从而产生通读转录本；而在细胞衰老、癌变和病毒感染等过程中也会发生转录通读。在该项目支持下，我们利用DRB处理细胞进行时序GRO-seq实验，开发了分析GRO-seq和DRB时序GRO-seq数据的工具，系统鉴定了不同条件下的转录通读事件，发现不同细胞在DRB处理的压力下均有大量基因发生转录通读。我们建立了DRB时序质谱技术，系统地筛选出转录终止调控因子候选库，包括已报道的调控蛋白和多个新蛋白，并重点围绕新候选蛋白X开展了分子机制的研究。我们利用siRNA敲低蛋白X并进行时序GRO-seq和CUT&Tag实验，发现蛋白X的缺失导致RNAPII转录终止异常，从而产生转录通读的新生RNA，表明蛋白X确实是一个重要的转录终止调控因子。进一步，我们通过Co-IP等实验发现蛋白X与CstF64互作，并确认CstF64的缺失会诱导细胞的转录通读。我们推测蛋白X通过招募CstF64在转录终止过程中发挥作用，目前正在进行更多的实验验证，以期揭示这一调控的机制和生物学功能。研究结果为解析细胞癌变和病毒感染过程中转录终止失调事件提供了线索和分子理论基础。项目负责人已发表项目标注SCI论文8篇，其中以通讯或共通讯作者发表研究论文7篇，以通讯作者发表综述1篇。目前还有转录通读调控的研究论文在准备中。此外，项目组已培养了2名博士和1名硕士研究生毕业，目前有多名硕博研究生在读。