以毛细管电泳为基础的酶切多肽反应全程的高时间分辨检测技术及应用研究

本项目以毛细管电泳为基础，建立一种柱上衍生、光门空位毛细管电泳（OGVCE）和激光诱导荧光（LIF）检测联用的新型实验技术，以羧肽酶的酶切多肽反应为研究对象，开展酶反应动力学的CE检测，以及肽链氨基酸组成和序列的在线测定研究。项目利用建立的柱上衍生OGVCE-LIF技术，通过对进入毛细管的多肽和氨基酸快速衍生化，对底物多肽和反应过程中的产物，包括所有氨基酸以及各种中间产物多肽，实现反应全程的快速高效分离、高时间分辨的高灵敏检测，获得酶切反应的详细动力学信息；通过分析反应中多肽和氨基酸信号强度随时间的演化，对肽链的氨基酸组成和序列实现快速准确的在线测定。项目旨在建立有效的研究复杂酶反应动力学的实验方法，发展以毛细管电泳为基础的在线测定多肽或蛋白质中氨基酸组成和序列的新技术，进一步拓展毛细管电泳在酶反应、氨基酸、多肽和蛋白质分析中的应用。

基于毛细管电泳（CE）在线酶分析方法以其特有的优势成为近年来一种备受关注的酶分析研究手段，但如何对酶反应全程实现精确的高时间分辨的在线测量仍是CE酶分析研究中一个具有相当挑战性的课题。项目针对这一课题，提出建立基于CE的自动序列分析方法，针对酶切蛋白及多肽反应，实现反应全程的快速高效分离、高时间分辨的高灵敏检测，获得酶切反应的详细动力学信息，并实现对肽链的氨基酸组成和序列快速准确的在线测定。.围绕项目的研究内容和目标，我们开展了以下主要研究工作：1）建立了基于CE的2-D扩散进样序列分析新方法，无需对毛细管的进样端进行任何操作即可实现高重现性的序列微量进样（RSD=1.01%，n=20）；建立了结合快速柱上衍生、光快门漂白进样技术和紫外检测的CE序列分析方法，对L-asparaginase酶反应实现了12s时间分辨的反应全程监测。2）对若干酶反应及抑制反应进行了反应全程的时间分辨在线监测，获得了准备的酶反应动力学信息。结合胶束电色谱技术，对氨基酸外消旋酶反应全程实现底物消耗和手性対映体产物增加的同步测量；以丙氨酸转氨酶为例，证实CE自动序列分析方法可用于监测不同抑制剂及其浓度对酶催化历程的影响；最新的工作成功实现了氨基酸成分和序列的在线测定，显示了CE自动序列分析方法在氨基酸分析中的应用潜力。3）率先报道了基于电泳媒介微分析的在线手性酶分析的研究工作；建立和发展了多种新型的毛细管酶微反应器，包括氧化石墨烯为酶固定的载体的层层自主装方法；以单颗粒为柱塞及大孔径粒珠为酶载体的填充式毛细管方法；以具有特殊性能的微米或亚微米尺度的磁珠固定的双酶毛细管微反应器；以及静电吸附方法制备的单层和多层葡萄糖-6-磷酸脱氢酶微反应器等。.上述研究工作在包括Anal Chem，J Chromatogr. A，Analyst，Talanta，Electrophoresis等分析化学领域国际知名刊物上发表基金标注SCI收录论文18篇（已被引用90余次），会议论文13篇。最近受Reviews in Analytical Chemistry杂志主编Prof. Israel Schechter的邀请，我们将对CE在线酶分析研究的最新进展做综述报道。在项目的资助下，培养获博士学位研究生1名，获硕士学位研究生6名，项目负责人被聘为教授、博士生导师，入选东北师范大学“东师学者”青年学术骨干培养计划。