基于毛细管电泳技术的微生物胞内目标代谢物在线分析

Quantitative measurement of intracellular microbial metabolites relates to understanding the network and flux of microbial metabolism. Based on high performance separation technique, to develop rapid, accurate and high throughput online analysis method for rapid and accurate determination of intracellular microbial metabolites is of great importance in controlling metabolic pathways, optimizing fermentation process, developing pharmaceuticals, investigating environmental microbiology, and so on. The proposal presents a novel method for online analysis of intracellular microbial metabolites based on capillary electrophoresis, which combines high throughput cell injection, fast online cell lyses, and high efficient separation and detection techniques. The study will focus on two kinds of target metabolites, i.e., monosaccharides and amino acids, which are important carbon source and nitrogen source in culture solution respectively. We will online measure the intracellular metabolites of several important microorganisms in synthesis of bio-products, with different culture environments and at different cellular growth time. By comparing the intercellular analysis results with those of extracellular measurements, we will analyze the dynamic change of both intracellular and extracellular metabolites. The purpose of the proposal aims at developing a simple, fast and efficient method for online analysis of intracellular microbial metabolites, adding our understanding of the microbial metabolic pathways and flux, thus exploring optimization and control of the yield of target bio-products. Our study will further expand the application of capillary electrophoresis in analysis of biological, complex and trace amount samples.

微生物胞内代谢物的定量水平关系着微生物代谢途径和代谢流量的掌握。基于高效分离技术发展快速、准确、高通量的在线分析方法对胞内代谢物进行精确测定，有助于微生物代谢途径的分析和调控，对发酵工业、生物制药、环境微生物等研究领域具有重要意义。项目提出以毛细管电泳分离技术为基础，建立集高通量细胞进样、快速在线细胞溶膜、以及高效分离检测于一体的新型微生物胞内代谢物在线分析方法，着重以微生物培养液中重要的碳源物质-单糖，和氮源物质-氨基酸作为目标代谢物分析，针对生物制品合成中若干重要的微生物，检测不同培养环境和细胞生长时刻的胞内代谢产物，并与胞外培养液检测结果对比，分析胞内外相关代谢物的动态变化。项目旨在建立一种简单、快速、高效的微生物胞内代谢物在线检测方法，加深对微生物代谢途径和代谢流的认识，探索对目标产物产率的优化和控制，进一步拓展毛细管电泳技术在生物、复杂及痕量物质分析中的应用。

基于高效分离技术—毛细管电泳（Capillary Electrophoresis，CE）—发展快速、准确、高通量的在线分析方法，对细胞内代谢反应、生物催化反应等实现精确测定，获得目标产物的动态变化，对生物医药、临床、环境等领域研究具有重要科学意义和应用价值，同时将推动和拓展CE技术在生物、复杂及痕量物质分析中的应用。项目执行期间，我们建立和发展了创新的CE在线分析方法，针对生物酶活性测定、蛋白酶切反应、细胞代谢反应等在线分析开展系统研究。研究成果在包括Analytical Chemistry、Biosensors and Bioelectronics、Analytica Chimica Acta等分析化学领域顶尖期刊上发表基金标注SCI收录论文19篇（其中包括两篇封面论文和一篇综述论文），申请获批专利2项。项目组成员多次参加国内外学术会议和交流，提交会议论文十余篇，并多次就项目研究成果做邀请报告。项目执行期间培养获博士学位研究生4名，获硕士学位研究生5名。.项目取得的主要创新研究成果叙述如下：.1）基于CE技术，建立了集合高通量进样-在线柱上衍生-时间分辨测量于一体的新型分析方法，成功应用于若干生物酶催化反应在线分析，提供了一种高效、便利、快速的在线测定多肽C端氨基酸序列的创新方法，实现了大肠杆菌细胞胞内代谢目标产物L-苯丙氨酸的在线连续监测，极大促进了CE技术在酶分析、蛋白分析、细胞代谢分析中的应用。.2）针对微型化和自动化的生物反应在线分析，基于CE技术建立和发展了一系列微型化反应器，实现了对酶活性及抑制反应、细胞胞内蛋白分析等快速高效在线分析。围绕CE酶微反应器，我们受邀撰写发表了近年来研究进展的综述文章，为相关研究提供参考和帮助。.3）提高CE技术的分离分析效率是实现复杂生物样品及痕量物质分析的必要条件。针对项目研究内容，我们通过拉伸毛细管、微萃取、场放大进样、毛细管内壁修饰等不同手段，进一步提高了CE分离检测效率及灵敏度，实现对痕量氨基酸等生物样品的灵敏检测。.项目研究提升了CE技术在线动态分析能力，拓展了其应用范围，为进一步研究奠定了更为坚实的基础。