CsVFB1调控黄瓜果实发育中期细胞膨大的分子机制研究

Fast fruit expansion is a significant feature of fruit growth for gourd vegetables. The exponential expansion of cucumber fruit mainly results from rapid cell expansion in the middle-stage of fruit development. Thus, the middle-stage fruit cell expansion is crucial for yield formation. Previously, a mutant with significantly decreased fruit length was identified. Fruit cell expansion in the mutant was inhibited but cell division was not altered, which makes it an ideal material for the study of fruit cell expansion in middle-stage of cucumber fruit development. The causative gene CsVFB1 was identified using MutMap method and its biological functions were confirmed by knock-out mutants generated by CRISPR/Cas9 mediated gene editing. CsVFB1 encodes an F-box protein, its homologous gene is known to participate in auxin signaling pathway to regulate cell expansion, but the specific mechanism remains elusive. This project aims to elucidate the function of CsVFB1 in regulating cucumber fruit cell expansion by analyzing its expression in fruit development, its regulatory network in auxin pathway and its directly interacting substrate for ubiquitination degradation. This study will contribute to reveal the molecular mechanism of cucumber fruit cell expansion and provide theoretical bases for molecular breeding.

果实快速膨大是瓠果类蔬菜作物果实发育的典型特点。黄瓜果实体积指数型增长主要由果实发育中期的细胞膨大所带动，因此中期果实细胞膨大对于产量形成至关重要。课题组前期发现了一个果实短小的突变体Csvfb1，该突变体特异抑制细胞膨大而不影响细胞分裂，是研究中期果实细胞膨大的理想材料。已利用MutMap定位了突变基因CsVFB1，并通过基因编辑技术敲除该基因进行了功能验证。CsVFB1编码F-box蛋白，已有的研究表明其同源基因参与生长素信号调控细胞膨大，然而其具体作用机制并不清楚。本项目拟在前期工作基础上，分析CsVFB1调控黄瓜果实发育的表达特征，解析其参与生长素信号调控果实发育的调控网络，筛选并验证其直接作用的泛素化底物，以初步解析CsVFB1调控黄瓜果实发育中期细胞膨大的分子机制。研究结果将有助于揭示黄瓜果实细胞膨大的调控机理，为黄瓜分子育种提供理论依据。

黄瓜 (Cucumis sativus L.) 果实的形态和大小是十分重要的农艺性状，影响黄瓜果实形态和大小形成的主要原因是细胞分裂与细胞膨大，其中果实发育中期细胞快速膨大是导致黄瓜果实体积指数型增长的主要原因，但目前相关调控机制尚不清楚。.课题组前期从黄瓜EMS诱变突变体库中筛选得到一个果实短小的突变体Csvfb1，使用MutMap方法定位到该突变基因，命名为CsVFB1。CsVFB1编码F-box蛋白，其可能通过特异性识别和促进底物的泛素化降解从而参与调控黄瓜果实发育，因此找到其底物蛋白对于揭示CsVFB1基因的调控机制至关重要。本研究以黄瓜品种406及突变体Csvfb1为研究材料，通过比较二者果实发育的形态学和组织细胞学差异，同时通过蛋白DIA定量技术筛选其泛素化底物并进一步验证，以揭示CsVFB1调控果实发育的分子机制。取得如下结果：.1. 通过对野生型和Csvfb1突变体果实心室数目,中果皮细胞面积和细胞数目的统计发现，导致Csvfb1突变体果实增粗的主要原因是心室数目增多进而引起的横截面细胞数目增多，导致Csvfb1突变体果实变短的主要原因是纵截面细胞膨大受到抑制。.2. CsVFB1突变会抑制SCF复合体对底物的泛素化进而影响其经26S蛋白酶体降解的过程，而MG132是一种泛素化蛋白酶抑制剂，可以抑制26S蛋白酶体的活性，进而影响所有泛素化降解途径，因此CsVFB1突变和MG132处理均会导致CsVFB1的底物蛋白大量累积。本研究通过蛋白DIA定量技术筛选相对于野生型406，在Csvfb1突变体中果皮中显著上调表达且在WT中经MG132处理后显著积累的蛋白质作为初步的候选底物，共筛选到19个候选底物。.3. 进一步通过萤火虫荧光素酶互补、酵母双杂交等实验鉴定CsVFB1蛋白与候选底物的直接相互作用，结果表明FE1和FE8蛋白与CsVFB1存在直接相互作用，可能为CsVFB1蛋白的泛素化底物。