基于同位素标记-生物质谱检测技术的糖组定量分析方法研究

It has considerable practical significance in seeking useful information about some diseases to study the information of glycome in cells in different states (physiological or pathological state). Biological mass spectrometry (MS) technology offers a powerful tool for glycomic study because of its trace, rapid, accurate and high-throughput. The existing methods based on the technology of table isotopic chemical labeling connected with mass spectrometry to quantify glycome relatively have some limitations. A new high-efficiency and high-throughput strategy to quantify N- or O-glycome by MS is proposed. In this strategy, the glycan's reducing end as a tagging site is labeled by 1, 3- substitutive pyrazolones isotopic reagents in alkaline medium. Some complex samples such as mucin (from porcine stomach), fetuin (fetal bovine serum) and blood serum will be chosen as test materials. O-glycan will be released from glycoprotein and tagged by 1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone (PMP) in one pot, and the new method of quantitatively analyzing O-glycan by MS with d0/d5-PMP isotopic labeling will be developed. That releasing N-glycan by glycosidase, releasing O-glycan in alkaline medium and labeling N-, O-glycan by PMP simultaneously will be combined effectively. Accordingly, a new method for simultaneous quantitative analysis of N-linked glycans and O-linked glycans by MS with d0/d5-PMP isotopic labeling will be developed. The research results are expected to solve the current questions in quantifying glycome by MS. It will provide a method reference for glycomic study of complex biological samples such as blood serum.

研究细胞在不同状态（生理和病理）下糖组的定性、定量信息，对探求某些疾病的发病机理具有重大的实际意义。生物质谱以微量、快速、准确和高通量的特点成为糖组研究的强大工具。现有的基于同位素标记技术的质谱相对定量糖组的方法存在局限性。本研究提出一种反应在碱性介质中进行，以1，3取代的吡唑啉酮类化合物同位素作标记试剂，对糖蛋白N-、O-糖链均实现以还原端为标记位点的高效、通量化的质谱定量糖组的方法。拟以猪胃粘蛋白、胎牛蛋白和血清等复杂样品为试验对象，采用"一锅法"解离和1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）同时标记O-糖链，开发d0/d5-PMP标记O-糖链的新方法，将酶解N-糖链、碱性释放O-糖链和同时标记N-、O-糖链有效结合，建立d0/d5-PMP同位素标记质谱相对定量同时分析N-、O-糖链的方法。研究结果有望解决当前质谱定量糖组中存在的问题，为血清等复杂生物样品的糖组学研究提供方法依据。

糖类物质的分析方法研究是糖组学发展的重要内容之一。研究细胞在不同状态下糖组的定性定量信息对于探求某些疾病的发病机理以及物种差异等具有重要的意义。针对现有的基于同位素标记技术的生物质谱相对定量分析O-糖链方法存在的局限性，在本本项目资助下，研究出了一种“一锅法”解离、d0/d5-PMP（1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮）同位素同时标记、质谱相对定量分析糖蛋白O-糖链的方法。该法和传统的甲基化或还原氨化同位素标记质谱定量分析方法相比，有如下优点：① O-糖链的解离和同位素标记通过“一锅法”同时完成，减少了样品处理步骤；② 同位素标记物对峰之间相差10 Da的固定分子量，在质谱图上便于对糖链峰进行分析；③ 糖链被标记上2分子d0/d5-PMP，疏水性提高，紫外吸收增强，特别适于RP-HPLC-UV的高分辨分离和高灵敏度检测。试验中将该法用在胎牛蛋白、猪胃粘蛋白以及鸡卵粘蛋白等标准糖蛋白中进行O-糖链的相对定量分析，结果表明该法具有较高的准确性和重复性。最后还将此法用到实际生物样品鱼卵糖蛋白O-糖链的分析，从不同角度成功地获得了鲑鱼卵和鲈鱼卵糖蛋白O-糖链定性及定量分析的精确数据，进一步证实了该法用于生物样品分析的可靠性，为实现血清等复杂样品中O-糖链的分析提供了参考。同时，该法也为d0/d5-PMP同位素标记质谱相对定量同时分析N-、O-糖链的方法建立奠定了基础。此外，在N-、O-糖链同时分析方法探索中，本研究提出的一种适于糖类物质分离富集的磁性复合材料[Fe3O4@SiO2 @NH2 @B(OH)2]设计思路，通过预实验制备研究已证实了可行性，为解决N-、O-糖链同时分析中的样品制备技术奠定了基础。. 衍生出的“3-氨基-9-乙基咔唑—邻甲酰苯硼酸荧光体系对糖分子的识别作用研究”对开发糖类物质的高灵敏度分析方法奠定了基础。辅研的“糖类物质制氢研究”从单糖、多糖水解制氢入手，在生物质制氢领域取得了突破性进展，探索出了一种利用过渡金属铱催化从非粮生物中低温高效制取氢气的方法，从糖类物质研究领域为能源转化、洁净能源制备提供了方法参考。