碱性鞘磷脂酶在肠道炎症粘膜屏障中的作用及其机制

Alkaline sphingomyelinase (alk-SMase) is the key enzyme in digestion of dietary sphingomyelin and specifically present in the intestinal tract. The previous research found human colonic tumorigenesis was accompanied with alk-SMase activity decreasing and gene mutation. Many studies have confirmed that SM and alk-SMase inhibit colonic tumorigenesis and it's well known that long-term chronic ulcerative colitis can be gradually evolved into colon cancer, so whether alk-SMase can work in inflammatory bowel disease (IBD)? In our previous knock out mice experiments, we have found alk-SMase activity deficiency would cause intestinal inflammation more severe in colitis model induced by DSS. This indicated that alk-SMase is a protective factor in IBD, but its molecular mechanism is not clear. Early studies have confirmed the mucosal barrier function of IBD is impaired, however, there have no research about the role of alk-SMase in intestinal barrier function. This project will be foucus on the physiological function of alk-SMase in intestinal tract and its molecular mechanism of alk-SMase as a protective factor in development of IBD. Our study aims to make alk-SMase become an indicator of IBD in early diagnosis and therapy.

碱性鞘磷脂酶(alk-SMase)是肠道中水解鞘磷脂(SM)的关键酶，研究发现在结肠肿瘤的发生发展伴随着alk-SMase的活性渐进性降低和基因突变，很多研究已证实了SM及alk-SMase可抑制结肠肿瘤的发生发展，而长期溃疡性结肠炎也可逐渐演变成结肠肿瘤，那么alk-SMase在肠道慢性炎症(IBD)中是否发挥作用？我们进行DSS诱导alk-SMase基因敲除小鼠结肠炎模型的前期实验发现alk-SMase活性缺失使肠道炎症发生的更加剧烈，已证实alk-SMase在IBD中的确起到了保护作用，但其机制还有待进一步研究。而IBD粘膜屏障功能受损早有研究证实，但alk-SMase在肠道屏障功能中的作用尚未见报道。因此，本课题主要研究重点是探明alk-SMase在肠道粘膜屏障中的生理功能及IBD发生发展过程中时发挥保护作用的机制，为alk-SMase成为肠道炎症早期诊断的指标提供科学理论依据。

碱性鞘磷脂酶(alk-SMase)又名NPP7，是肠道中负责水解鞘磷脂的关键酶。Alk-SMase具有磷脂酶C的活性，可水解鞘磷脂(SM)产生神经酰胺，神经酰胺具有抗增殖和促凋亡特性的脂质信使分子；还能从血小板活化因子(PAF)和溶血磷脂酰胆碱中分离磷酸胆碱，导致PAF失活和溶血磷脂酸(LPA)降低。PAF和LPA都与炎症性肠病和癌症密切相关，因此alk-SMase被认为具有抗炎和抗癌特性。本项目的研究中采用6-8周龄KO和WT小鼠连续8天给予3% DSS饮水诱导结肠炎症模型来研究alk-SMase对肠道粘膜屏障的功能。通过肠道组织病理分析病理学评分和小鼠疾病活动指数评分。通过Western blotting和免疫组化分析NPP2在肠道中的表达，ELISA分析NPP2、PAF、LAP、IL6、IL10、TNFα表达情况。小鼠肠道粘膜的RNA-seq测序及生物信息学分析筛查出上调、下调的肠道屏障相关基因。结果发现，与WT小鼠相比，KO小鼠炎症反应更加剧烈。DSS 2天，KO小鼠结肠黏膜中PAF明显升高，IL10明显降低，PAF、IL6、TNFα在初始增加后期又出现大幅度下降。在KO小鼠中，LPA呈现出显著渐进性增加，这与小肠和结肠固有层免疫和内皮细胞中NPP2表达升高有密切关系。NPP2上调与PAF的早期升高相一致。我们对小鼠的肠道粘膜基因表达数据进行分析，识别出97个基因差异表达mRNA，其中32个基因表达上调，65个基因表达下调。经过基因功能富集分析后发现，这些差异表达基因跟消化、脂质代谢、钙离子依赖磷脂绑定、免疫系统等相关功能关联密切。以上结果表明，alk-SMase基因缺陷后，小鼠对致炎因子的抵抗能力明显降低，说明了alk-SMase在IBD发病过程对肠粘膜屏障功能的重要保护作用，同时阐明alk-SMase通过改变肠道粘膜组织中脂质分子发挥保护肠道粘膜屏障的分子机制；小鼠肠道粘膜的RNA-seq测序系统地检测分析alk-SMase在肠道屏障功能中的作用。通过本项目的研究，为alk-SMase成为肠道早期炎症诊断的一个指标提供科学的理论依据。另外可将alk-SMase作为治疗因子，试图找到一种切实可行的方法防治慢性肠道炎症性疾病的发生发展，为IBD的治疗开辟一条新的道路。