与PKR蛋白激酶相互作用的先天免疫相关蛋白的鉴定和功能分析

细胞先天免疫反应所诱导合成的细胞因子是细胞抵抗病原微生物侵染的重要天然防线。先天免疫反应的信号通路以及相关蛋白的研究，长期以来都是国际上的焦点问题。双链RNA依赖性蛋白激酶（PKR）是我们已证实的、非常重要的一个先天免疫调控蛋白；PKR的激酶活性是其调控机制的一个必需因子。由此我们推测，PKR调控先天免疫信号传导的分子机制是通过与其它蛋白分子相互作用与磷酸化的过程。为了鉴定这些与PKR相互作用的蛋白组分，本项目拟采用基因转染、二维电泳、免疫共沉淀、质谱分析和生物信息学、免疫荧光显微检查等手段筛选候选蛋白,并分析它们与PKR的相互结合关系。最后通过RNA干扰和基因转染，验证PKR与候选蛋白相互结合在先天免疫信号传导过程中的生物学意义。本项目的实施将揭示PKR调控先天免疫信号通路的分子机制，有助于全面阐明先天免疫信号传导网络的结构和功能，也为预防和治疗感染性疾病提供新的靶点。

细胞先天免疫反应通过诱导干扰素等细胞因子表达，构成细胞抵抗病原微生物侵染的重要天然防线。先天免疫反应的信号通路以及相关蛋白的作用机制，近年来成为国际上的焦点问题。本项目通过串联亲和纯化技术，和质谱鉴定分离鉴定了与双链RNA调控的蛋白激酶（PKR）的蛋白，并通过分子生物学，细胞生物学和病毒学技术深入研究了它们参与先天免疫的信号传递的功能与可能机制。研究取得的主要成果包括：..1，利用分子克隆、基因转染、蛋白电泳和Western blot、免疫共沉淀等技术，建立了两个筛选与PKR相互作用的候选蛋白的平台。.2，通过质谱鉴定获得了两个与PKR发生相互作用的蛋白（RHA,HSPA6）。.3，通过免疫共沉淀证实了PKR与RHA的相互作用，并确定PKR的双链RNA结合结构域是两者发生相互作用的关键区域。.4，完成了RHA的功能研究。证实RHA是登革病毒复制过程中的重要宿主因子，提出登革病毒复制过程中可以招募RHA，一方面作为病毒RNA复制的重要桥因子，另一方面可以降低其刺激诱导的固有免疫应答的科学假说。.5，首次发现PKR蛋白负调控登革病毒诱导的干扰素产生，并发现PKR通过RIG-I,IPS调控了先天免疫信号转导通路，影响了下游IRF-3,MAPK和NF-B等分子的激活水平，从而负调控干扰素的产生。.6，发现dsRNA分子佐剂PIKA可通过激活先天免疫信号通路，产生干扰素，抑制登革病毒的复制。..总之，本研究围绕PKR,PKR相互作用蛋白(RHA)，以及参与先天免疫应答的相关分子（如病原识别相关分子模式dsRNA分子）,对先天免疫的信号通路进行了有趣的探索。这些研究成果帮助阐明了先天免疫信号通路的分子机制，并为感染性疾病的防治提供一些新的靶点和措施。