基于酶糖链转移反应与稳定同位素标记受体的N-糖链定量分析

Protein glycosylation as one of the most common covalent posttranslational modifications has a significant effect on the structure and functions of proteins.Recent studies have demonstrated that many diseases are related to the alteration of glycans attached to proteins. Therefore, through the quantitative analysis of glycans, we can accurately find the abnormal changes of sugar chain happened in disease,which will play an inestimable role in the diagnosis and treatment of diseases.At present,the chemical labelings based on mass spectrum detection are effective analytical methods for glycan, whereas these techniques need additional chemical reactions in the process, may bring side-effects, have adverse influence on both marking and sample purification. Fortunately,enzymic transglycosylation reaction of Endo-M,Endo-M-N175Q can overcome the defect of above method.Endo-M and Endo-M-N175Q could transfer the intact complex oligosaccharide in the glycopeptide to suitable acceptors during hydrolysis of the glycopeptide. In this project, we plan to synthesize some kinds of light and heavy stable isotope labeling acceptors, which can improve sugar chain transfer rate, mass spectrum detection sensitivity and resolution. Based on the enzymic transglycosylation reaction, then we will develop a new glycan quantitative method, chemoenzymatic isotopic labeling, and use standard sugar peptide to study the linearity and repeatability of the method. This technique will be applied to the analysis of the actual sample to verify the effectiveness of the proposed method. The suggested technique can be applicable for both qualitative and relative quantitative analysis of glycans in glycomic studies, quality control and comparability assessment of glycoprotein products as well as the analysis of glycan alteration in some diseases.

作为一种普遍存在的翻译后修饰，糖基化对蛋白质的结构和功能有着重要影响。研究认为人类许多疾病的发生和发展都与蛋白上N-糖链的结构和表达量的改变有关，通过N-糖链定量分析，可以精确地寻找疾病中糖链发生的异常变化，对疾病的诊断和治疗起着不可估量的作用。目前基于质谱检测的化学标记是进行N-糖链定量的有效方法，但这些技术都需要在实验过程中进行额外的化学反应，对标记效果和样品的纯化都有不利影响。Endo-M、Endo-M-N175Q酶转糖基反应可以很好地解决上述问题。该酶可以在切N-糖链的同时，将糖链转移到糖基受体。在本研究中，拟合成几种可提高糖链转移率、质谱检测灵敏度和分辨率的轻、重稳定同位素标记的受体，基于该酶反应，发展全新的N-糖链定量方法-酶法标记技术，利用标准糖肽考察方法的线性和重现性。将该方法应用于实际样品的分析，验证其有效性。本研究建立的N-糖链相对定量方法对差异性糖组学研究有重要意义。

化学酶法标记在糖链分析中具有广泛的应用前景。Endo-M是一种β-N-乙酰氨基葡萄糖苷内切酶。它不仅水解糖蛋白/糖肽N-糖链中两GlcNAc之间β1-4糖苷键，从而释放N-糖链和带有GlcNAc的蛋白/多肽外，还具有转糖基活性，能够将寡糖转移到带有GlcNAc标签的化合物，在两个GlcNAc之间形成新的糖苷键。Endo-M及其突变体Endo-M N175Q在合成带有均一糖链的糖蛋白和糖肽上得到了应用，但在糖组学领域研究甚少，仅在寡糖的定性研究中有少量涉及。鉴于此，本项目建立基于酶糖链转移转移反应与稳定同位素标记受体的N-糖链定量分析方法。首先，设计制备能够提高糖链转移率和质谱检测灵敏度的6种同位素标记受体，并对其结构进行表征。这6种受体易溶于水或极性有机溶剂。这些特性有利于酶反应。其次，以唾液酸糖肽（SGP）作为糖肽模式分子、比较Endo-M和Endo-M N175Q的转糖基活性。结果表明，与Endo-M相比Endo-M N175Q的转糖基活性更高、寡糖衍生物更稳定。因此，选择Endo-M N175Q进行下一步的糖链分析研究。优化了酶反应条件，结果在pH6.5的磷酸缓冲溶液、温度为32°C、受体的摩尔浓度与糖肽摩尔浓度比值大于4，反应时间为3 h时，转糖基衍生物的质谱峰面积最大。采用反相色谱柱，以梯度洗脱方法分离目标物，以优化的质谱检测条件进行检测寡糖同位素标记物。对峰之间的适宜质量差[4（[M+2H]2+） 或2.7 Da （[M+3H]3+）]有利于常规质谱仪的使用。然后，该方法应用于核糖核酸酶B、卵清蛋白、胎球蛋白中N-糖链检测，并分别检测到5种、9种、7种N-糖链。这说明该方法适用于糖蛋白糖链定性分析，也为定量分析方法的建立提供依据。最后，以d0/d8 PEPZ-Boc-GlcNAc为受体、以SGP为糖基供体，采用LC-ESI/MS，考察了SG标记物的线性、动态范围及重现性。结果表明，在10倍动态范围内，相互定量方法呈良好的线性关系（R = 0.999）和重现性（CV = 3.4%）。该方法具有操作简便、标记反应在酶解过程中进行，不需要额外的反应试剂，不会产生副反应。该方法能够应用于糖蛋白/糖肽样品中的N-糖链含量分析、糖肽药物的质量控制、对差异糖组的研究有重要意义。