偶联连接酶和高保真聚合酶提高核酸分子识别特异性的研究

分子诊断在个体化医药学中具有重要地位，提高核酸检测方法的特异性，是目前开发核酸检测新方法的主要目标。近年来，我们开发了具有二位点多碱基识别功能的高保真DNA聚合酶介导的分子开关技术，并已运用于多种基因单位点的突变识别检测中。鉴于核酸连接酶对底物分子同样具有多碱基识别能力，本申请拟研究连接酶与高保真聚合酶的偶联反应体系，以达到对待测核酸分子进行至少四位点多碱基的更高精度和更大范围的识别。该新技术的高敏感性和高特异性的研究，有助于多点突变或复杂突变的体细胞突变位点检测，为提高核酸分子识别检测技术的特异性研究开辟新的方向。

病原体的早期诊断和快速筛选中，不同酶所介导的分析方法在提高核酸分子识别效率方面具有很大应用前景。鉴于单一酶在病原体检测方面的不足，本项目利用酶的偶联来提高检测的特异性、敏感性以及检测反应的快速性。项目实施过程中，创新性研发了适用于多点辨认的半引物，建立了连接酶－高保真聚合酶偶联的分子识别体系。该识别体系具体工作策略：利用连接酶识别内外侧半引物与待测模板的缺口位点，使半引物连接成全引物，再利用高保真DNA聚合酶的5’→3’聚合活性和3’→5’外切活性识别全引物3’末端的硫化修饰位点，检测待测模板是否含有突变点，以此达到利用偶联两种不同的酶反应过程对同一待识别的核酸分子进行四次串联的分子识别目的。实验结果包括：1）优化一种可使核酸连接酶和高保真DNA聚合酶同时工作的单一缓冲液；2）优化和确定用于连接酶反应与高保真DNA聚合酶介导的突变敏感性分子开关的半引物对中，内侧半引物与外侧半引物同待测核酸分子互补部分的长度；3）优化和确定用于连接酶反应与高保真DNA聚合酶介导的突变敏感性分子开关的半引物对中，内侧半引物与外侧半引物之间的浓度比例；4）建立了连接酶反应偶联高保真DNA聚合酶反应在普通PCR与荧光定量PCR检测的标准反应流程；5）建立了针对HIV病毒保守序列所设计的四位点多碱基核酸辨认方法，并在合成模板上进行特异性和灵敏性的验证。本项目在生物技术领域首次提出半引物概念和首次使用半引物，增加了DNA连接酶在核酸分子识别中的应用价值，在技术领域达到对核酸分子识别的高特异性和高敏感性的统一，为开发新型病原体检测方法提供理论依据和实验基础。