针对TERT启动子突变的二苯甲酮类化合物CL248抗肝癌活性及机制研究

Primary hepatocellular carcinoma (HCC) is one of the most common malignancies causing global public health burden. Recent advances discovered high frequency of telomerase reverse-transcriptase (TERT) promoter somatic mutations in HCC, whereas no similar mutations were observed in normal liver tissues, suggesting that TERT promoter mutation may serve as a new therapeutic target. In our previous study, we identified a benzophenone derivative (CL248) that selectively inhibited the transcriptional activity of TERT promoter mutations by using a luciferase reporter gene strategy. Moreover, CL248 treatment significantly suppressed the survival of TERT promoter mutation HCC cells compared with TERT promoter wildtype HCC cells. In this project, we will explore the effects of CL248 on the selective inhibition of TERT promoter mutation HCC cells through cellular and animal models (including Patient-derived tumor xenograft model) in vitro and in vivo, and clarify the downstream effectors and signal networks of CL248. We will also evaluate the advantages of CL248 on the treatment of TERT promoter mutations HCC patients compared to existing telomerase inhibitors. Our study will reveal the potential of CL248 for TERT promoter mutations targeted therapy in HCC patients.

原发性肝癌是临床上常见的恶性肿瘤之一，严重危害人类健康。近年来研究发现端粒酶逆转录酶（TERT）基因启动子在肝癌中频繁出现2个位点的热点突变，而在正常肝组织中没有发现突变，提示TERT启动子突变能够作为潜在的治疗靶点。我们前期通过荧光素酶报告基因系统，筛选到了二苯甲酮类小分子化合物CL248能够选择性抑制TERT启动子突变型的转录活性，并且CL248对TERT启动子突变型肝癌细胞的抑制率显著高于TERT启动子野生型。本项目拟在前期工作基础上，构建TERT启动子突变型和野生型肝癌细胞，利用细胞、动物模型，并收集临床新鲜肝癌组织，建立PDX模型明确CL248选择性抑制TERT启动子突变型肝癌细胞的作用，阐明CL248作用的药物靶点及分子机制，比较CL248与现有端粒酶抑制剂对TERT启动子突变型肝癌细胞治疗效果和毒性副作用的差异 ，明确CL248作为治疗TERT启动子突变型肝癌的潜在应用价值。

近年来研究发现在肝癌患者中端粒酶逆转录酶（TERT）启动子频繁出现2个热点突变（-124G>A和-146G>A），而在正常细胞中没有发现TERT启动子突变。目前已报道的靶向端粒酶的各类抑制剂对端粒酶活性阳性的正常细胞均存在一定的毒性作用，限制其临床应用。本项目针对TERT启动子突变，筛选并鉴定到一个二苯甲酮类化合物（命名为CL248）能够选择性抑制（-124G>A）突变型TERT启动子的转录活性以及TERT表达、端粒酶活性和端粒长度。我们通过体内体外实验证实CL248对TERT启动子突变型肝癌细胞的杀伤作用显著高于TERT启动子野生型肝癌细胞。机制方面，我们发现CL248能够显著抑制NF-kB p52亚基和RNA聚合酶Pol II募集至突变型TERT启动子，并且选择性抑制肝癌细胞中RelB mRNA表达，降低RelB与DNA的结合能力，而对RelA的表达与DNA结合能力没有影响，提示CL248可能通过抑制NF-kB信号通路进而降低突变型TERT启动子的转录和TERT表达。我们利用转录组测序筛选到114个差异表达的基因受到CL248调控，并且证实CL248处理后能够显著抑制β-catenin在TERT启动子突变型（-124G>A）肝癌细胞核中的聚集以及降低β-catenin的转录活性。CL248与β-catenin抑制剂XAV-939或者特异性针对β-catenin的小干扰RNA联用，能够显著增强CL248对TERT启动子突变型肝癌细胞的杀伤作用。此外，我们对CL248与端粒酶抑制剂（BIBR1532）治疗效果比较发现CL248能够选择性杀伤TERT启动子突变型肝癌细胞，而BIBR15322对TERT启动子突变型和野生型肝癌细胞的抑制作用没有明显差异。我们利用临床肝癌组织样本，发现NF-kB p52亚基在肝癌组织中表达显著高于癌旁组织；生存分析证实p52高表达的肝癌患者其预后更差。本项目研究阐明CL248选择性抑制TERT启动子突变型肝癌细胞生长的作用，揭示CL248通过抑制非经典NF-kB信号通路降低突变型TERT启动子的转录，从而抑制TERT表达，最终导致TERT启动子突变型肝癌细胞端粒长度缩短以及死亡的分子机制，为CL248用于治疗TERT启动子突变型肝癌患者提供了理论依据。