高致病性2型猪链球菌Ⅳ型分泌系统效应分子的鉴定及功能研究

Streptococcus suis serotype 2 (SS2) has become a highly invasive pathogen that was found to be the cause of two large-scale outbreaks of streptococcus toxic shock syndrome (STSS) in China. Currently, the mechanism by which the SS2 to cause STSS is still unknown. We have reported a functional type IV secretion system (T4SS) harbored by the unique 89K pathogenicity island (PAI89K) contributes to the development of STSS. The T4SS induces the transfer of some pathogenic effectors that may elicit excessive systemic inflammatory responses. However, the pathogenic effectors transferred by the T4SS remain to be elucided. In the present study, we plan to identify the effectors not only based on the functional components of T4SS, but aslo based on comparative proteomics. Then, we will determine the effectors of T4SS through western blot analysis in the SS2 infected cell models. Finally, we will investigate the role of the effectors in the virulence of SS2 and the development of STSS with animal models. The primary aim of this project is to elucidate the pathogenesis of STSS caused by the highly pathogenic SS2 isolates.

2型猪链球菌（SS2）是重要的人畜共患病病原体，近年来出现的高致病性SS2可引起人感染出现"链球菌中毒性休克综合征"（STSS）的临床表型，病死率高。目前，高致病性SS2引发STSS的机制还不清楚。已有研究报道一个89K毒力岛为高致病SS2所特有。申请者前期通过对89K毒力岛进一步生物信息学分析，发现该毒力岛5'端编码了一个Ⅳ型分泌系统（T4SS），并且这个T4SS通过分泌效应分子，与STSS的发生密切相关。然而，该系统究竟分泌了何种效应分子尚有待阐明。本项目拟从T4SS的组分分析及比较蛋白质组学两方面入手，找出T4SS的效应分子；然后在细胞模型上鉴定效应分子是否经由T4SS分泌；最后，通过构建T4SS效应分子缺失的突变株，在动物模型上对效应分子在SS2致病机制中的作用进行研究。本项目的实施不仅有利于阐明高致病性SS2引发STSS的机制，还可为研制有效的分子疫苗奠定基础。

项目背景：2型猪链球菌（SS2）是重要的人畜共患病病原体，近年来出现的高致病性SS2可引起人感染出现“链球菌中毒性休克综合征”（STSS）的临床表型，病死率高。目前，高致病性SS2引发STSS的机制还不清楚。本项目前期研究报道该高致病SS2所特有89K毒力岛上编码了一个IV型分泌系统（T4SS），并进一步研究证实这个T4SS通过分泌效应分子，与STSS的发生密切相关。然而，该系统究竟分泌了何种效应分子尚有待阐明。主要研究内容：本项目从比较蛋白质组学入手，找出T4SS的效应分子；然后进一步利用western blot等手段鉴定效应分子是否经由T4SS分泌；最后，通过构建T4SS效应分子缺失的突变株，在动物模型上对效应分子在SS2致病机制中的作用进行研究。研究结果及关键数据：本项目通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）技术，筛选到T4SS的候选效应分子，并通过文献等证据将研究对象确定为其中的类枯草杆菌丝氨酸蛋白酶（Subtilisin-like serine protease，SspA）。然后分别在转录水平、效应蛋白分泌水平以及蛋白质相互作用水平对其进行验证。证实了SspA-1的分泌确实依赖于T4SS的存在。最后，动物攻毒实验表明sspA-1基因缺失的SS2对小鼠的致死性减弱以及刺激小鼠产生炎症因子的能力大大降低。说明T4SS的效应分子SspA为SS2致病性及致炎能力的关键因子，在高致病性SS2引发的STSS中发挥了重要作用。科学意义：本项目研究结果不仅有助于阐明我国高致病性SS2引发STSS的分子机制，还可为研制有效的分子疫苗以及设计靶标药物奠定基础。此外，SspA-1是目前第一个被鉴定出来的革兰氏阳性细菌IV型分泌系统的效应分子。目前针对T4SS的研究主要围绕革兰阴性菌展开，对于革兰阳性菌T4SS的结构组成和功能还知之甚少。我们对2型猪链球菌IV型分泌系统及其效应分子的研究，对深入认识革兰阳性菌T4SS的结构和功能，以及阐明革兰阳性菌的致病机制并寻找新的治疗靶点具有重要的理论和现实意义。