羊无浆体IV型分泌系统效应分子的鉴定及功能研究

The survival and reproduction in the host cell play an important role in the pathogenesis of Anaplasma, which is an obligatory intracellular bacterium. However, the information related to invasion and pathogenic mechanism of Anaplasma are scarce. The type IV secretion system (T4SS) is a multi-protein complex and secret virulence factors into host cell. T4SS involve in the transport of macromolecules and delivery of bacterial DNA into target cell and is more associated with host pathogenesis. The primary results of genome sequence revealed that A. ovis encode the type IV secretion system (T4SS) VirB/VirD4. In the present study, we will identify the T4SS in the Anaplasma ovis by comparative genomics. To identify potential T4SS effectors, A. ovis genomic DNA library was screened by bacterial two-hybrid system using A. ovis VirD4 as bait. Interaction between coupling protein VirD4 and effectors will be verified by Pull-down and co-immunopreciapitation. The transcriptional difference and localization of effector proteins will be analyzed in infected host cell. The function of obtained effector proteins will be investigated in the yeast model system. These results will provide theory basis for the survival and replicate in host cell as well as pathogenic mechanism of A. ovis.

无浆体是一类专性细胞内寄生菌，胞内生存和复制是无浆体致病的关键环节，但有关无浆体对宿主细胞入侵和感染致病机制的研究较少。IV型分泌系统（T4SS）是一种能分泌细菌毒力因子的多蛋白复合物，参与大分子跨膜转运，还可介导细菌基因水平转移，且与细菌致病性更是密切相关。课题组前期研究表明羊无浆体编码细菌IV型分泌系统VirB/VirD4。本项目拟以羊无浆体为研究对象，应用比较基因组学方法，明确T4SS在羊无浆体中的组成。以T4SS偶联蛋白VirD4为诱饵，通过细菌双杂交、pull-down和免疫共沉淀技术，以期获得与羊无浆体T4SS相关的效应蛋白分子。进一步，分析无浆体感染宿主细胞效应蛋白分子转录水平的差异并将其进行组织定位。依据效应蛋白分子功能结构域和信号序列，分析与宿主细胞的相互作用，利用酵母系统验证获得的效应蛋白分子的功能。最终为揭示羊无浆体在细胞内生存复制、致病机理和靶向治疗等提供理论基础。

羊无浆体是由媒介蜱传播的细胞内寄生菌，可以引起绵羊、山羊、鹿等反刍动物发病。IV型分泌系统（T4SS）是一种能分泌细菌毒力因子的多蛋白复合物，参与大分子跨膜转运，还可介导细菌基因水平转移，且与细菌致病性更是密切相关。本项目利用本实验室分离保存的羊无浆体分离株，通过高通量测序完成了羊无浆体全基因组序列的测定、组装和注释；羊无浆体基因组为一条环状染色体，基因组大小1,214,674 bp，G+C含量为49%，含有933个CDS和和37个tRNA，与其他已知无浆体病原类似；开展了比较基因组学研究，为后续羊无浆体的研究提供了数据支撑。解析了羊无浆体IV型分泌系统蛋白复合体的组成，由11个virB2、4 个virB6、2个virB4、2个virB8、2个virB9、以及virB3、virB7、virB10、virB11和virD4基因编码，缺少VirB1和VirB5。应用免疫共沉淀、SDS-PAGE 和高效液相色谱-电喷雾串联质谱(LC-ESI-MS/MS)等技术，进行羊无浆体主要免疫原性蛋白的筛选；鉴定出羊无浆体主要免疫原性蛋白aaap，并且基于该蛋白建立了检测羊无浆体病的ELISA技术，为该病的防控提供了技术手段。对羊无浆体Msp1a基因进行分析，其编码的msp1a蛋白的末端重复序列含有功能性结构域、B细胞和中和抗原表位，并基于msp1a对羊无浆体菌株进行了分子分型，共鉴定出羊无浆体19个基因型。构建了羊无浆体媒介蜱唾液腺和中肠的酵母双杂交文库，构建了羊无浆体多个主要抗原基因的诱饵质粒，将利用酵母双杂交技术筛选出羊无浆体与媒介蜱相互作用的蛋白，进一步挖掘病原与媒介之间的相互作用关系，将为羊无浆体病的防控提供理论依据。在本项目的支持下，开展了新发蜱传人畜共患无形体病原的研究：确定了我国绵羊和山羊中存在嗜吞噬细胞无形体新的生态型，首次证实了白牦牛中嗜吞噬细胞无形体和牛无浆体的感染，证实了新发蜱传细菌山羊无形体在自然界中存在两个基因型。