罗非鱼应答碱胁迫过程中关键microRNAs的筛选及功能鉴定

Nile tilapia is a suitable model organism to study the physiology of stress resistance. The microRNA (miRNA) participates in regulating almost every biological process by controlling post-transcriptional level of the target genes. It is still unknown which miRNAs are in respond to alkali stress of the Tilapia miRNAs already identified. Hence, in this project, we will firstly screen out differential expression miRNAs among the alkali-treated and control group using high-throughput sequencing in Nile tilapia (gill/kidney/liver). Secondly, miRNAs target genes will be verified, and the spatial and temporal expression profile of these miRNAs and target genes be constructed under alkali stresses, and then identify miRNAs associated with the physiology of stress (blood pH, concentration of HCO3- and NH3). Finally, we will conclude using miRNA overexpression (agomir) and inhibition (antagomir) to analyze the biological function of the 2-4 selected miRNAs under alkali stress in tilapia. The fulfillment of this project will help us to understand miRNAs molecular regulation mechanism of the alkali-tolerance in tilapia, and provide a theoretical basis and basic data for the study of physiology of stress resistance and the utilization of the aquatic biological resources.

罗非鱼应答碱胁迫是研究鱼类逆境生理的适宜模型。microRNA（miRNA）通过对靶基因的抑制来调控各项生物过程。在已发现的49个尼罗罗非鱼应答碱胁迫（鳃组织）差异表达的miRNAs中，尚不清楚究竟哪些miRNAs对罗非鱼耐受碱胁迫起重要调控作用。为此，本项目首先用高通量测序在正常和碱胁迫罗非鱼（腮、肾、肝脏组织）中筛选显著差异表达的miRNAs；然后预测并验证miRNAs的靶基因，分析它们的时空表达谱，确定和碱胁迫以及罗非鱼体内生理变化（血清pH、血清碳酸氢根离子浓度、血氨）相关的miRNAs；最后用miRNAs过表达（agomir）和抑制（antagomir）等，阐明2-4个关键miRNAs在罗非鱼应答碱胁迫过程的生物学功能。本项目的顺利完成，有助于了解miRNAs在罗非鱼应答碱胁迫过程中的分子调控机制，为揭示罗非鱼抗逆生理的分子机制和水产生物资源开发利用提供理论参考和资料积累。

本项目首先通过高通量测序对在不同碳酸盐碱度胁迫下的罗非鱼进行转录组和miRNAs组研究，并进行关联，综合分析其响应和适应的分子机制。转录组实验中发现，鳃中的类固醇生物合成通路、肾脏中的药物代谢通路和肝脏中的蛋白质消化吸收通路随碱度变化持续富集。在鳃、肾和肝中分别共享12、4和2个差异表达显著且随碱度持续变化基因。结果说明与盐胁迫相比，碱胁迫对与水直接接触的鳃组织的损伤更大。肾脏主要参与排毒。脂质代谢（涉及信使分子、信号转导）、解毒和免疫在罗非鱼响应和适应碱度胁迫中作用的更为突出。miRNAS组实验中共鉴定出276个已知miRNAs，其中包括63个差异表达显著且随碱度持续变化miRNAs。随机选取4个随碱度变化持续变化（上调或下调）和3个随碱度变化不持续变化的miRNAs进行RT-qPCR验证，结果表明这些差异表达的miRNAs参与了罗非鱼应答碱胁迫的过程。结合转录组数据对上述7个miRNAs的靶基因进行预测和KEGG pathway通路显著性富集分析，发现钙信号通路和MAPK信号通路等显著富集。 最后，项目深入研究了miR-26a的功能，发现其在脑，腮组织中高表达，且随碱胁迫碱度增高/时间延长而表达增加；活体内注射特异性miR-26a抑制剂可以降低罗非鱼体内氨浓度，减弱离子波动，提高罗非鱼抗氧化作用；结合双荧光报告和活体实验验证了miR-26a的靶基因为HSP70和 GS。本项目的研究结果一定程度上反映了是鱼类适应环境压力的共性，为揭示鱼类适应环境胁迫（抗逆生理）的分子机制提供理论基础，为水产生物资源开发利用，尤其是耐盐碱罗非鱼新品种的选育提供理论参考和资料积累。