利用CRISPR-Cas13a技术靶向抑制登革病毒复制的实验研究

A recently developed RNA targeting tool “CRISPR-Cas13a” has shown to effectively binding and disrupt single-strand RNA expression in mammalian and plant cells, and this tool has been used to inhibit viral replication in plant cells. To explore its potential for developing into a novel reprogrammable anti-viral therapeutic strategy in human viral diseases and optimize the technology schemes in the anti-viral application, we use dengue virus (DENV) as a research object and establish an optimized anti-viral method based on CRISPR-Cas13a through screening efficiency crRNAs and finding suitable dose and time. Besides, using deep sequencing and single-cell transcriptome sequencing, we explore the mechanism of its anti-viral effect and find a more accurate way to evaluate the off-target effect of CRISPR-Cas13a. This study will provide a novel and effective way to inhibit DENV infection, and lay a theoretical foundation for inhibition of other RNA virus using CRISPR-Cas13a technology.

近年来，新一代的RNA靶向技术CRISPR-Cas13a已被证实可在植物细胞及哺乳动物细胞内靶向剪切单链RNA，并且该技术已被用于在植物细胞内的抗病毒研究。为探索CRISPR-Cas13a技术用于人类病毒性疾病中抗病毒研究的可行性以及更好地优化该技术的抗病毒方案，本研究以登革病毒为研究对象，通过筛选高效crRNA靶点、探索最佳使用剂量及给药时间，建立并优化基于CRISPR-Cas13a的抗登革病毒技术方案，通过深度测序和单细胞转录组测序探索该技术剪切病毒RNA的作用原理并评估其在抗病毒时的脱靶效应。本研究将为抗登革病毒的研究提供一种新的策略，同时也为今后利用该技术开展抑制其他RNA病毒的研究提供理论及技术支持。

登革热（Dengue fever，DF）由登革病毒（Dengue virus，DENV）感染引起，是目前全球仅次于疟疾流行最广、最为严重的虫媒病毒传染病之一。最新调查结果显示，目前全球约36亿人生活在DF流行区，每年约4亿人感染DENV，1亿人出现临床症状，超过200万人发展为重症DF，2万多人死亡。此外由于全球气候变暖，国际旅游和商务活动增加等因素，登革的流行趋势不断上升，分布范围进一步扩大，已经成为一个严重的世界性公共卫生问题。因此探索新的抗病毒技术和策略是目前登革病毒研究的热点方向。CRISPR-Cas13a系统已被证明能够有效降低哺乳动物和植物细胞中的RNA表达。在本项目中，我们从10个靶向登革病毒基因组的CRISPR RNA（crRNA）中筛选出了抑制效率最高的crRNA（NS3-crRNA）。病毒载量检测结果显示，含有NS3-crRNA的CRISPR系统抑制了细胞内72%的病毒载量。空斑实验结果显示，含有NS3-crRNA的CRISPR系统可以抑制细胞内92%的活病毒数量。此外，我们利用TA测序在NS3区附近也发现了缺失和插入突变，提示这种抑制作用除了靶向降解病毒核酸外还与NS3基因突变相关。总之，本研究建立了一种基于CRISPR的抗登革热病毒新技术，有望为抗登革病毒药物发展和其他RNA病毒的治疗提供新的策略。