利用transgenic RNAi技术在家蚕滞育种中抑制核型多角体病毒复制增殖的研究

通过转基因干扰技术抑制病毒复制关键基因从而达到抑制病毒增殖、使宿主获得病毒抗性是近年来抗病毒治疗领域研究的热点。转基因干扰对病毒的抑制效率在很大程度上决定于所构建载体的结构，包括启动子的选择、靶标基因特异序列的选择以及靶标基因正反向连接片段的选择等。本项目选用家蚕肌动蛋白A4启动子、BmNPV病毒ie-1基因启动子与BmNPV病毒复制必需基因ie-1,gp64, lef-1, lef-2, dnapol, 病毒囊膜糖蛋白基因gp64进行多重组合，选用功能性内含子连接靶标基因正反向片段，基于piggyBac转座子载体,构建多个病毒转基因干扰载体，并以生产现行滞育蚕种两广2号母种"932"、"7532"作为转基因受体材料，通过显微注射获得相应的转基因株系，筛选能高效抑制BmNPV复制增殖的转基因株系对应的干扰载体。研究结果有助于阐清家蚕的BmNPV致病机制，并将为新型抗病品种选育技术提供支撑。

选用家蚕肌动蛋白A4启动子、BmNPV病毒ie-1基因启动子、IE1结合hr3增强子的启动子与BmNPV病毒复制必需基因ie-1, helicase, vp39, 病毒囊膜糖蛋白基因gp64进行多重组合，选用功能性内含子连接靶标基因正反向片段，基于piggyBac转座子载体,构建多个病毒转基因干扰载体，并以生产现行滞育蚕种两广2号母种“932”作为转基因受体材料，通过显微注射获得相应的转基因株系，筛选能高效抑制BmNPV复制增殖的转基因株系对应的干扰载体。后期抗病毒能力测试结果显示，不同的病毒干扰载体获得的转基因家蚕，其抗病毒能力均得到了一定程度的提高，转基因株系的死亡率最高可减少30%；在这之中，干扰载体中靶标基因以 “头对头”的连接方式优于“尾对尾”的连接方式，耦合Hr3片段的IE1启动子优于IE1和A4启动子，IE1基因是最佳的候选靶标基因。在完成好项目任务之外，项目组还通过转基因增量表达抗病毒蛋白脂肪酶1和美国白蛾NPV病毒hycu-ep32基因，成功增强了家蚕对BmNPV病毒的抵抗力。研究结果说明，通过RNA干扰和增量表达抗病毒蛋白均能较好的提高家蚕对病毒的抵抗能力，是基于基因工程培育抗病品种的可行方法。此外，项目组也对家蚕抵御病毒的机制进行了初步探索，研究结果初步表明RNA silencing基因网络是家蚕抵御病毒的途径之一。