鞘糖脂对登革病毒复制组装的影响及其机制研究

Dengue virus (DENV) infection is one of the most serious infectious diseases in the world, and there is no effective vaccine or specific antiviral drugs against DENV. Study the detail mechanism of virus infection is important for us to develop new antiviral strategy. The life cycle of Dengue viruses relies on the complex endomembrane system of the host cell(such as endoplasmic reticulum, Golgi apparatus and vesicles). Glycolipids are a group of membrane associated components in animal cells. Most glycolipids exist as glycosphingolipids. Our preliminary experiments suggested that the DENV could not infect GM95 cells,,a mutant B16 melanoma cell line,which lacks in glycosphingolipids .And we found that DENV could attach to the cell surface and entry into GM95 cells normally ,but could’t accomplish viral replication and assembly. We will further study the ability of DENV replicating and assemblying in cells deficient in glycosphingolipids, using a variety of techniques including immunofluorescence, thin layer chromatography (TLC)-binding assay, mass spectrometry (ms), virus titer determination and quantitative PCR.This study will help us to understand the detail function of glycosphingolipids during DENV infection. This will be the first time to show the novel function of glycosphingolipids in DENV infection. And this work will also contribute to the development of new anti-viral drugs based on glycosphingolipids.

研究登革病毒感染宿主细胞的机制对于抗登革病毒感染具有重要意义。登革病毒在宿主细胞中生命周期离不开内质网，高尔基体，囊泡等细胞内膜系统，膜的主要成分是脂类。我们发现登革病毒不能有效感染鞘糖脂缺失的小鼠黑色素瘤细胞GM95。预实验排除了鞘糖脂参与登革病毒吸附到细胞表面及入胞过程，并且通过检测细胞内登革病毒负链RNA复制量及细胞中病毒滴度分析，确认了在鞘糖脂缺失的情况下登革病毒不能有效复制组装。我们将在前期工作基础上，采用荧光共定位、薄层层析结合实验、 质谱分析、 细胞病毒感染、 定量PCR等多种技术手段，深入研究鞘糖脂参与登革病毒复制组装的分子机制，了解其在登革病毒感染细胞后的复制组装过程中的作用，并探讨该机制在不同种类宿主细胞中是否具有广泛性。本项目将首次揭示鞘糖脂在登革病毒感染中的作用及其分子机制，并为抗登革感染提供新靶标。

登革病毒是引起人类疾病最重要的虫媒病毒，病毒感染导致流感样症状，严重时引起发病率和死亡率很高的登革出血热和登革休克综合征。在无安全有效疫苗和特效药物的情况下，对登革病毒感染机制和有效抑制手段的探索十分重要。鞘糖脂是由神经酰胺和糖类构成的糖脂分子，普遍分布于真核细胞的膜类结构上。近期，有研究报道鞘糖脂参与病毒感染的过程，然而具体作用仍不明确。本项目中，我们揭示了鞘糖脂不参与登革病毒吸附及入胞过程，与登革病毒 RNA 复制复合物共定位验证其参与病毒的复制组装。.我们采用小鼠皮肤黑色素瘤细胞系B16细胞和缺失鞘糖脂的突变体GM95细胞作为研究的细胞模型，并选用神经节苷脂GM3（基于其在糖脂合成系统中的重要性及其生物学功能的丰富性）作为鞘糖脂代表进行研究。通过实验发现，两种细胞对于病毒的吸附及入胞区别不大。而当抑制B16 细胞中鞘糖脂的合成时，登革病毒感染水平显著下降；干扰B16 细胞中三种主要鞘糖脂合成酶 (mt3gal5, ma4GalT or mb3GnT)，登革病毒感染水平显著下降；补充外源鞘糖脂至缺失鞘糖脂的GM95 细胞，登革病毒感染水平显著上升；登革病毒复制子在B16 细胞中的复制水平显著地高于GM95 细胞；鞘糖脂影响登革病毒复制子在B16 和GM95 细胞中的复制。以上揭示鞘糖脂影响病毒的复制。.我们进一步实验发现鞘糖脂 GM3 与登革病毒 RNA 复制复合物的组成成分之一非结构蛋白NS4A在内质网膜区域有部分共定位，揭示了鞘糖脂影响病毒复制的方式。. 最后，为在动物层面验证GM3对登革病毒感染的影响，我们对3-4日龄乳鼠脑内接种100PFU的登革病毒混合15ug的GM3抑制剂大豆皂苷Soyasaponin I，并以不加大豆皂苷组作为对照组。实验发现Soyasaponin I显著降低感染登革病毒的乳鼠死亡率。为验证Soyasaponin I是否通过抑制病毒的复制来保护小鼠，分别检测了感染2天和4天后小鼠脑组织中的登革病毒复制水平，Soyasaponin I处理组中登革病毒复制水平显著降低。这些结果进一步显示，鞘糖脂GM3显著影响登革病毒复制阶段，靶向鞘糖脂的合成可成为抑制病毒感染的新思路。