枯草芽孢杆菌fengycin合成的信号分子调控机理研究

Fengycin is an antifungal lipopeptide produced by Bacillus sp. with non-ribosomal peptide synthetases. It inhibits strongly filamentous fungi and has the important applications potential in the prevention of food preservation and plant pathogenic fungi, Recently, there are a lot of studies on antimicrobial lipopeptides produced by Bacillus subtilis such as the fermentation on surfactin , fengycin, and its synthetic enzymes and synthetic enzyme genes in worldwide. There are few reports on the mechanism that signal proteins regulate on fengycin synthesis at molecular level. However, the mechanism of molecular regulation for the fengycin synthesis is unknown upto now. In order to clarify the mechanism of molecular regulation for the fengycin synthesis, The effect of knockout and overexpression of the regulatory signal protein genes, ComA, PhrC, AbrB, Spo0A, DegU and sigma factor in B. subtilis on fengycin synthesis are studied and the relationship between signal regulatory protein and transcription, expression of fengycin synthases genes or synthsis metabolism process is investigated.Our results provide a scientific basis for improving the production of fengycin at molecular level in B. subtilis.

fengycin是由芽孢杆菌非核糖体合成的抗菌脂肽，具有高效的抑制丝状真菌的作用，在食品防腐和植物病原真菌的防治等方面具有潜在的应用前景。国内外对枯草杆菌fengycin的发酵生产、合成酶及合成酶基因已有较多研究，但尚未阐明fengycin合成的分子调控机理。因此，对于分子水平改良fengycin生产菌株，尚缺乏信号分子调控fengycin合成的科学依据。针对这一科学问题，本研究利用fengycin生产菌株B. Subtilis ATCC9943，通过敲除和过表达枯草杆菌中信号调控蛋白的基因，探索信号调控蛋白及σ因子对fengycin合成的影响，结合荧光定量PCR和蛋白质组学的方法，推测信号调控蛋白对fengycin合成基因的转录和翻译的影响，分析与合成代谢过程的关系，揭示信号蛋白对fengycin合成的分子调控机理，为从分子水平上改造枯草芽孢杆菌提高fengycin的产量提供科学依据。

Fengycin是一类由芽孢杆菌通过非核糖体合成途径代谢产生的抗菌脂肽，由于缺乏对该抗菌脂肽合成调控机制的认识，其发酵产量一直较低，进而限制了fengycin作为新型食品保鲜剂在工业上的大规模应用。本项目旨在分析影响fengycin合成代谢的关键调控因子及其调控机制，进而为产fengycin芽孢杆菌的分子改造提供理论基础。在该项目的资助下，我们分别利用营养代谢分析、基因组改组、基因敲除与过表达技术对fengycin合成代谢进行了研究。营养代谢分析显示，解淀粉芽孢杆菌在含有果糖的MLF培养基内fengycin合成代谢被显著增强，利用转录组测序及蛋白质组分析技术对不同营养条件下解淀粉芽孢杆菌的fengycin合成代谢进行研究，结果发现果糖作为一个关键营养因子可以有效提高与fengycin合成相关的底物氨基酸的代谢过程，进而为fengycin合成提供结构元件；同时，fengycin合成酶基因的表达量被显著上调，与之相关的转录调控因子AbrB及信号蛋白（PhrC，ComA，Spo0A）及sigma H出现显著差异表达，为fengycin转录调控机制的探索提供了参考。通过对解淀粉芽孢杆菌进行诱变结合基因组改组技术，获得了一株遗传性能稳定的fengycin高产菌株，结果显示改组后菌株fengycin产量是出发菌株的2.03倍，其fengycin合成酶基因（fenA）上调明显；利用双向电泳分析解淀粉芽孢杆菌基因改组前后细胞蛋白差异表达情况，共鉴定获得45个蛋白质点，为筛选与fengycin合成相关的功能蛋白提供了基础。结合营养代谢与基因改组的分析结果，我们构建了PhrC，ComA，AbrB，Spo0A敲除突变体及ComA与ComK过表达突变体，证明了不同信号蛋白及转录因子与fengycin合成酶基因的调控关系。利用凝胶阻止结合Dnase footprint分析发现，转录因子AbrB作为一个负调控因子参与fengycin合成调控，获得了Abrb在fengycin上游转录调控区的特异性结合位点。在本项目的资助下，我们对解淀粉芽孢杆菌fengycin合成代谢模式进行了研究，明确了转录因子AbrB对fengycin合成代谢的影响，推测了fengycin合成调控通路图，为解淀粉芽孢杆菌的分子改造及fengycin高产菌株的获得提供了理论基础。