HPV16整合所致宿主顺式元件变异在子宫颈上皮内瘤变进展中的作用及分子机制研究

Integration of HPV into the host genome is a key step in the development of cervical intraepithelial neoplasia (CIN). In our previous studies on CIN patients, we found several HPV16 integration sites associated with cis element variations and extensive cis element interactions on host genome. Does HPV16 integration lead to cis-element variation of the host genes at the whole genome level? How will these variations affect the host gene expression patterns? Which host gene expression changes are directly associated with CIN progression? In order to answer these questions, we will study the cis-element interaction variations, cis-element sequence variations and host gene expression profile variations in HPV16-integrated CIN patients by Hi-C, whole genome sequencing and transcriptome sequencing. On top of this, we will identify variations of key genes and corresponding cis-elements responsible for the abnormal transformation of CIN cells as well as the effects of these variations on downstream signaling pathway components, and verify the association between the variations on the expression patterns of these genes and the progress of CIN both in vitro and in vivo. This study is expected to provide the theoretical basis for CIN diagnose and treatment.

人乳头瘤病毒（HPV）整合到宿主基因组是子宫颈上皮内瘤变（CIN）发生与发展的关键步骤。此前课题组在CIN患者中检测到HPV16整合位点周边的宿主DNA存在顺式元件序列变异及广泛的顺式元件互作关系。HPV16整合是否会在全基因组水平上导致宿主顺式元件变异，这些变异将对宿主基因表达产生何种影响及导致CIN发生发展的机制目前尚不清楚。本项目，将通过高通量染色体构象捕获技术（Hi-C)，全基因组测序及转录组测序的方法研究HPV16整合的CIN患者顺式元件互作关系变异，顺式元件序列变异以及宿主基因表达谱变异。在此基础上，将鉴定与CIN细胞异常转化相关的关键基因表达模式变异及相应的顺式元件变异，及这些变异对下游信号通路的影响。并在体内、外水平上验证这些基因的变异在CIN进展中的关键作用，进而揭示HPV16整合所致的CIN中涉及到的关键分子机制及靶点，为CIN的诊断与治疗提供理论依据。

宫颈癌是全球女性癌症死亡的第四大原因，高危型人乳头瘤病毒(High risk human papillomavirus，HR-HPV) 基因组整合是诱导宫颈癌前病变/癌发生的关键因素，并与患者临床不良预后相关。尽管当前研究初步揭示HR-HPV通过末端连接或重组修复机制随机整合至宿主基因组，引起整合位点周边宿主基因组不稳定，但目前缺少针对病毒整合致癌机制的系统性研究。本项目利用高通量染色体构象捕获（High-through chromosome conformation capture,Hi-C）技术、染色质免疫沉淀测序(ChIP-seq)、芯片捕获、全基因组测序（WGS）、二代、三代RNA测序等技术和分子生物学技术，在基因组、转录组和染色体结构水平对HR-HPV整合致癌机制进行深入研究。.主要研究结果包括：（1）Hi-C数据分析发现整合位点周边存在显著的基因组顺式元件变异现象，HPV16整合引入新的绝缘子导致拓扑相关域(TAD)边界的滑动，破坏宿主原有顺式调控元件的互作关系，顺式元件变异引起的转录组水平的变化。（2）HR-HPV主要整合在人内含子和基因间区，整合位点附近宿主基因存在大量的基因缺失和插入，且随着病变加重，基因组中HR-HPV整合位点增多；（3）整合热点基因中包含抑癌基因MACROD2、LRP1B在内的多个肿瘤相关基因，被整合基因涉及复杂的蛋白质互作网络；（4）RNA-seq数据显示HPV16整合后大量基因表达发生改变，差异表达基因主要富集在癌症相关通路。整合可产生融合转录本，以高频整合位点MACROD2基因形成的融合转录本最为常见。融合转录本数量与宫颈癌患者的临床分期、病理分级正相关；（4）三代转录组测序结果证明HPV-宿主融合转录本具有特异的组成结构，可归纳为HPV E6(spliced)-E7-E1(spliced)-human gene，联合整合位点及特异性mRNA检测可作为HR-HPV持续感染与宫颈癌前病变分流的指标，并可预测宫颈癌前病变进展风险。.结论：本项目阐明HR-HPV整合通过重构宿主的顺式元件互作关系，影响宿主肿瘤相关基因表达，产生特异性HPV-人基因融合转录本，影响肿瘤相关基因表达和蛋白互作，进而参与宫颈癌前病变发生发展的分子机制，为理解HPV16整合诱导的宿主基因组三维结构变化及其在宫颈癌瘤发生中的作用提供了重要的依据。