HIV-1 Gag识别基因组RNA二聚体的机制的研究

Packaging is an important step in HIV-1 life cycle. During this process, HIV-1 Gag recognizes genomic RNA (gRNA), forming new virus. The infectivity of the newly-produced virus will be greatly reduced if packaging does not occur properly. Thus, interfering packaging can be developed as a new anti-HIV-1 therapeutics. However, several important questions remain in the field, including why HIV-1 always packages two copies of gRNA. Recently, it was shown that gRNA is packaged as a dimer, providing an explanation for the pseudodiploid nature of HIV-1. During dimerization, the conformation of the gRNA 5´-untranslated region undergoes significant changes, possibly presenting high-affinity Gag binding sites. Here, I propose to develop an in vitro system to mimic the Gag-gRNA recognition process. Binding experiments will be used to investigate Gag´s affinity to stabilized gRNA monomer and dimer. And probing experiments will be performed to define critical interaction regions on gRNA. The results will help to understand the selection mechanism for gRNA dimer. The Gag-gRNA system developed can also be used as a platform for identifying lead compounds targeting packaging.

包装是HIV-1复制的重要环节。在这一过程中，HIV-1 Gag蛋白识别其基因组RNA (gRNA)，形成新的病毒。当包装发生错误时，新生成的病毒的感染能力会大大降低。因此，干扰包装过程有望成为一种新的抑制HIV-1的手段。然而，包装过程中的一些关键科学问题还有待解决。其中包括：HIV-1为什么总是包装两条gRNA？研究发现，gRNA是以二聚体为单位被包装的，为这一现象提供了一种解释。在由单体形成二聚体的过程中，gRNA 5´端非编码区域的构象会发生变化，可能形成高亲和力的Gag结合位点。本项研究力图构建一个体外实验体系，模拟Gag识别gRNA的过程。利用结合实验，比较Gag与gRNA单体、二聚体的亲和力，并寻找二聚体上高亲和力的Gag结合位点。旨在从分子水平上明确Gag选择gRNA二聚体的机制。所构建的Gag-gRNA识别体系将为以干扰包装过程为目标的药物开发提供技术平台。

在HIV-1包装过程中，HIV-1 Gag蛋白识别其基因组RNA (gRNA) 并将其包装到新形成的病毒颗粒中。Gag蛋白与gRNA的5´端序列（5´L）的相互作用是启动包装过程的关键。HIV-1总是包装两条基因组RNA，但控制gRNA包装数量的机制尚未被完全阐明。研究发现，5´L能通过构象变化调控gRNA的命运。当5´L采取一种构象时，gRNA形成二聚体并被包装到病毒中（这种构象被称为包装构象）；当5´L采取另一种构象时，gRNA形成单体并被翻译为Gag蛋白（这种构象被称为翻译构象）。 我们假设，具有包装构象的5´L可以与Gag更好的结合，从而促进gRNA二聚体的包装。在本研究中，通过理性的分子设计和体外实验体系的构建，我们发现5´L构象显著影响Gag-RNA相互作用：与具有翻译构象的模式5´L分子（5´LT）相比，具有包装构象的5´L分子（5´LP）可以结合更多的Gag分子。Gag与5´LP的结合速度更快，解离速度更慢，并且他们形成的复合物在高盐溶液条件或者有其他竞争性RNA存在时更稳定。Gag中NC-SP2-p6结构域是导致Gag与5´LP独特结合模式的主要区域。以上结果提示，HIV-1 gRNA 5´端序列的构象变化在病毒选择性包装其基因组的过程中扮演重要角色。包装构象不仅能够促进gRNA发生二聚化，还能使gRNA与Gag形成的复合物更稳定并存在更长的时间，有利于招募更多Gag分子，启动包装过程。综上所述，我们发现Gag与gRNA结合的动力学和稳定性可以影响包装过程，提出了一种HIV-1选择性包装gRNA二聚体的新机制；这些结果也为抗HIV-1药物的开发提供了新思路和新方法，具有重要的理论意义和潜在的应用前景。