HIV-1 CRF07_BC 病毒P6Gag蛋白变异的病毒学特征及其分子机制研究

Human immunodeficiency virus type 1（HIV-1）circulating recombinant form （CRF）07_BC is the most prevalent strain in China. Patients infected with CRF07_BC had slower disease progression than patients with subtype CRF01_AE and B infection.A unique deletion of seven amino acid (30PIDKELY36) and/or PTAPPE duplication were observed to exist exclusively in p6Gag of CRF07_BC. Its association with disease progression and its replication mechanism remain to be elucidated. P6Gag recruit the cellular protein Tsg101 and Alix to facilitate virus budding.Furthermore, due to the overlap of the open reading frames for the p6Gag and p6Pol proteins, the mutations may affect the activity of HIV-1 protease,which in turn interfere the HIV-1 replication. The purpose of this study is to generate HIV-1 mutant viruses and to evaluate the effect of these mutations on viral release efficiency, Gag processing, viral infectivity and replication capacity. The mechanisms are needed to elucidate that p6Gag mutation affect the Tsg101 and Alix binding and further affect the virus budding. Also studies are needed to characterize that P6pol mutation impair Protease and reverse transcriptase activity and further affect the viral infectivity and replication capacity. This work will clarify the associations of the viral characteristics of CRF07_BC mutations with clinical and epidemiological studies , and provide new prospects to the prevention and therapy of HIV-1 infection.

CRF07_BC是我国HIV-1主要流行株之一，感染该病毒者疾病进展较感染CRF01_AE和B型者慢，部分该基因型病毒p6Gag存在特征性连续7个氨基酸PIDKELY缺失和/或PTAPPE插入突变，这些突变与疾病进展关系及影响病毒复制机制尚不清楚。p6Gag与宿主蛋白Tsg101和Alix作用调控病毒组装和释放，p6Gag和p6pol表达框部分重叠，p6Gag变异可能影响p6pol活性，进而影响HIV复制。本项目采用反向遗传学方法构建携带上述突变HIV质粒，研究突变病毒生物学表型变化，尤其是病毒组装和释放、感染力、病毒复制能力，确定p6Gag突变与Tsg101和Alix作用对病毒组装和释放影响及机制，及通过影响HIV蛋白酶和逆转录酶活性影响病毒复制和感染力的分子机制，揭示CRF07_BC变异病毒学特征及与临床和流行病学关联，为HIV感染和复制机制研究提供新思路，为HIV感染防治提供科学依据

CRF07_BC是我国HIV-1主要流行株之一，感染该病毒者疾病进展较感染CRF01_AE和B型者慢，部分该基因型病毒p6Gag存在特征性连续7个氨基酸PIDKELY缺失和/或PTAPPE插入突变，这些突变与疾病进展关系及影响病毒复制机制不清楚。.本项目采用反向遗传学方法，（1）构建7个氨基酸缺失（∆7）、PTAPPE 插入以及7个氨基酸缺失合并 PTAPPE 插入（P∆7）的 HIV-1 p6Gag突变质粒，探讨病毒的释放、成熟、感染力和复制能力等病毒学特征。（2）进一步研究p6蛋白7个氨基酸缺失突变（∆7）影响病毒表型的分子机制。通过构建Gag∆7和GagPol∆7质粒，确定Gag蛋白氨基酸缺失还是Pol蛋白氨基酸缺失对于病毒表型影响较大。（3）构建p6蛋白第36位Y缺失突变（K-∆Y36）、第30-35位（PIDKEL）缺失突变（K-∆630-35）和第30-36位（PIDKELY）缺失突变质粒（K-∆730-36），评价突变病毒释放效率和Gag蛋白加工效率，并进一步探讨p6氨基酸缺失病毒与Alix V（364-716）蛋白的相互作用。（4）通过qPCR分析病毒4种逆转录产物含量：R-U5（初始产物）、U3-U5（负链合成产物）、R-5’UTR 和 Gag（正链合成产物）研究p6∆7对病毒逆转录进程的影响。.结果发现：（1）HIV-1 p6Gag蛋白7个氨基酸（∆7）缺失是导致病毒释放、成熟缺陷、感染力降低，在T细胞内不能有效复制的主要原因。（2）∆7主要通过影响 p6Gag蛋白而不是Pol蛋白抑制病毒释放和成熟，其中第36位酪氨酸（Y）是导致病毒表型缺陷的主要氨基酸，它的缺失影响YPXnL与Alix蛋白结合，从而抑制病毒释放。（3）HIV-1∆7突变使病毒释放减少、病毒感染力降低、逆转录过程的DNA合成减少，导致病毒复制周期延长，可能是造成 CRF07_BC感染后疾病进程缓慢的原因。 .本项目通过构建突变质粒，系统地研究p6Gag蛋白突变对病毒释放、成熟、 感染力和复制能力的影响，研究结果有助于阐明我国 CRF07_BC变异株的病毒学特征及其快速传播流行的分子机制，揭示 HIV-1 p6Gag蛋白在病毒感染和复制中的作用及其可能的机制，为HIV-1 感染和复制机制研究提供新思路，为HIV-1感染防治提供科学依据。