多维一体化生物质谱方法的建立及其对膜蛋白复合物结构功能和调控机制的研究

Central to molecular medicine are protein machineries which maintain homeostasis, and their roles in the cells of healthy and diseased individuals, of which 50% are membrane embedded. However many of these machineries continue to resist structural and dynamical elucidation due to their amphipathy, hetetrogeneity, and close partnership with membrane lipids for proper activity. Consequently the ultimate goal of a high resolution four dimensional view of the cell remains distant. Alternative strategy is therefore required at the frontiers of biomedical research. Here we propose an integrated mass spectrometry approach targeted at membrane protein complexes exploring every aspects ranging from their interactions with lipids to low resolution structural models. Our vision is to develop mass spectrometry and complementary techniques to investigate the structure, dynamics and interactions of membrane associated macromolecular assemblies in disease. As such we will strive to extend the approach from structural biology to molecular medicine.

分子医学的核心在于我们对细胞内外药物靶向体系的结构，相互作用，功能调控以及其与疾病关系的精确理解，已知至少有50%的药物靶标位于膜上。而膜蛋白的研究由于其两亲性，不均一性以及对膜上脂分子的依赖一直以来都是结构生物学的瓶颈。本项目立足于当今世界飞速发展的质谱分析技术，利用质谱方法固有的优势，结合非变性质谱，蛋白质组学方法，离子迁移质谱，以及脂分子定性定量技术等，寻求建立并完善多维一体化的生物质谱方法并将其应用于一系列目标膜蛋白复合物，以深入了解它们在细胞膜上的动态结构，功能调控，并探索脂分子对膜蛋白结构和功能的作用，力求多角度多层次描述生物分子复合物的相互作用机制，并由此探究它们在健康生物体正常功能和疾病相关功能故障的分子基础，为疾病诊断和药物的定向设计提供帮助与导向。

随着现代生物技术的高速发展，越来越多的科研人员把研究重心转移到膜蛋白的研究上。细胞膜是生物体系最为重要的细胞器官，它不仅仅起着细胞内外环境的屏障，而且是细胞内外信息传递的重要通路，也是细胞识别系统标志物的聚集地，目前已知的至少50%的药物靶点位于膜蛋白上。然而，膜蛋白由于其身处于流动的磷脂双分子层环境中，而细胞膜内外两端又处于极性环境体系，这样的不均一性大大阻碍了膜蛋白的结构生物学研究进展。. .本项目立足于质谱分析技术，寻求建立并完善多维一体化的生物质谱方法并将其应用于一系列目标膜蛋白复合物，以深入了解它们在细胞膜上的动态结构，功能调控。在本基金的支持下，我们搭建了国内首个膜蛋白非变性质谱平台，可以对膜蛋白以及膜蛋白复合物开展质谱学方面的结构生物学研究。同时，我们搭建了自动化氢氘交换质谱平台，并将原有商用仪器的上样体积由微升级别提高到了纳升级别，大大降低了珍贵生物样品的用量。通过对质谱仪进行了大胆改装和升级，我们将分子量检测极限推高到>1000,000Da，远高于目前国内市场上商用质谱仪器的检测上限（20,000Da）。. .我们利用建设完成的仪器平台对细胞膜环境中的EmrE的拓扑构象与其亚基共价修饰的关系展开研究，首次提出并证实了膜蛋白复合物在天然环境中的构象异质性，即膜蛋白可以通过其一级序列的共价修饰来调控其四级结构。通过对细菌脂多糖（LPS）跨膜转运机器的动态聚合及协同机制开展了研究，并首次在质谱实验中观察到LptDE复合物与LPS分子的结合。通过对BtuF与配体的离子淌度质谱研究，我们发现了BtuF与VB12的结合有别于“维纳斯捕蝇草”的独特配体结合模型。我们对于膜蛋白非变性质谱开展了一系列方法学研究，不仅找到了一种可以实现在低能态下进行膜蛋白离子化的方法从而更好地将膜蛋白保持在天然状态，我们还成功地实现了利用结构性肽段模拟膜环境将膜蛋白复合物实现膜蛋白可溶化处理。