GDF6基因突变导致多发性骨性连接综合征的致病机制研究

Multiple synostoses syndrome (SYNS) is a rare autosomal dominant skeletal dysostosis characterized by defects in joint formation and synostoses. In the prior study, we successfully identified a heterozygous mutation (p.Y444N) of GDF6 gene by exome sequencing in a large Chinese pedigree of SYNS. Segregation of this missense mutation in the pedigree members, then the GDF6 gene was confirmed as a novel pathogenic gene in SYNS. GDF6 gene encodes a member of the BMP family, and is required for normal bone development and tendon formation. However, the pathological mechanisms of SYNS is still unclear. This study intends to use the technologies of Western blot, surface plasmon resonance, chicken micromass cultures and CRISPR/Cas9 gene editing etc., uniting the results from in vitro experiments and in vivo animal models. We'd like to assess the the potential pathogenicity of GDF6 missense mutations (p.Y444N), including protein expression, receptor and inhibitors binding affinity, and downstream signaling pathways. We'd also like to study the expression patterns of GDF6 and receptor in mouse embryonic development, and observe the pathological phenotype of the mutant mouse. The purpose of our planed study is to clarify the pathogenic mechanisms of the mutation p.Y444N leading to SYNS, and to further explore the role of GDF6 gene in the formation of bone and joint, and in the development of cartilage and tendon.

多发性骨性连接综合征（SYNS）是一种以全身多发骨关节融合为主要特征的遗传性骨骼系统疾病，多呈常染色体显性遗传。课题组前期在一个庞大的SYNS家系中，利用全外显子组测序技术成功鉴定到GDF6基因杂合错义突变p.Y444N。该突变与家系成员骨融合表征完全共分离，确认GDF6为SYNS新致病基因。GDF6基因属于BMP家族成员，参与骨骼的发育及肌腱的形成，但其具体致病机制不清。本研究拟运用表面等离子共振、鸡胚胎肢芽细胞微团培养和CRISPR/Cas9基因修饰等实验方法，结合体外细胞实验和动物模型研究。评估错义突变p.Y444N对GDF6蛋白表达、与受体和抑制剂结合亲和力及下游信号通路等的影响。研究GDF6及其受体在小鼠胚胎发育过程中的时空表达模式，并观察突变小鼠的病理表型。从而阐明GDF6基因突变p.Y444N导致SYNS的致病机制，并进一步探讨GDF6在骨关节形成、软骨及肌腱发育中的作用。

遗传性多发性骨性连接综合征（multiple synostoses syndrome，SYNS）是一种以全身多发骨关节融合为主要特征的遗传性骨骼系统疾病，多呈常染色体显性遗传。本项目前期在一个庞大的SYNS家系中，利用全外显子组测序技术成功鉴定到生长分化因子6（ growth differentiation factor 6，GDF6）基因杂合错义突变p.Y444N。该突变与家系成员骨关节融合表型完全共分离，确认GDF6为SYNS新致病基因。GDF6属于BMP家族成员，参与骨骼系统发育，但其基因突变导致SYNS的具体致病机制不清。本项目通过构建GDF6野生型和GDF6 p.Y444N突变型表达载体，进行体外功能研究，分析GDF6 p.Y444N突变对GDF6表达和功能的影响；通过CRISPR/Cas9 基因编辑技术建立Gdf6 p.Y443N突变小鼠模型，研究GDF6 p.Y444N突变对骨关节发育和表型的影响。体外功能研究发现，GDF6发生p.Y444N突变后，其活性不受拮抗剂Noggin抑制，与野生型GDF6蛋白相比，GDF6 p.Y444N突变蛋白表现出更强的刺激ALP生成、激活BMP信号通路以及刺激软骨细胞生长的能力。小鼠模型研究发现，Gdf6 p.Y443N杂合突变小鼠主要表现为腕骨、跗骨部位关节融合，再现了SYNS患者表型；Gdf6 p.Y443N纯合突变导致的关节融合表型更为严重，此外还可导致第一指/趾短小以及第二三趾并趾，这些骨关节的异常严重影响了Gdf6 p.Y443N纯合突变小鼠的运动能力；Gdf6 p.Y443N突变不仅阻碍了腕骨、跗骨等处关节的正常发育，也破坏了出生后指/趾骨关节稳态维持，导致进行性指/趾骨关节融合。通过本项目研究，阐明了Gdf6突变导致SYNS的分子致病机制，即GDF6发生p.Y444N突变后，其活性不受拮抗剂Noggin抑制，导致其活化BMP信号通路的能力增强，使间充质细胞向软骨细胞过度分化，阻碍了关节正常发育和维持，导致关节融合表型。本项目研究结果加深了我们对骨关节发育和维持的认识，本项目中建立的Gdf6 p.Y443N小鼠模型可进一步用于SYNS治疗相关研究，所研究的GDF6 p.Y444N突变对骨关节组织损伤治疗药物的研发提供了非常有价值的线索。