NRF2/PPARγ通路调控脑出血NS/PCs炎性微环境促神经再生的作用及机制研究

Our preliminary research has demonstrated that inflammatory microenvironment after ICH encountered by NS/PCs has an important role on the neurogenesis of stem cells, as well as on the restoration of the neurological deficits of animal models. Nrf2/PPAR-γ signal pathway is the key of the antiinflammatory and antioxidant effect.Therefore, According to the establishment of experimental ICH model of the rats, and the application of multiple researching methods such as EMSA,RT-PCR,Western blot,FCM and confocal microscopy, the study try to probe the mechanism of how Nrf2/PPAR-γto modulate neuroinflammation, to reveal its effect on NSCs niche, and thus to confirm the effect and mechanism of Nrf2/PPAR-γ signal pathway modulating the migration, proliferation and differentiation of stem cells. The outcome is helpful to exploit a combination of various drugs, which can perform dual roles in modulating the robust inflammatory attack as well as making an attempt to regulate the neurogenesis pattern in the desired way.

我们的前期研究工作表明ICH 后炎性微环境是阻碍移植的NS/PCs的神经发生能力及ICH动物模型功能恢复的主要机制之一，而Nrf2/PPAR-γ在机体抗炎和抗氧化应激中起着关键的作用。因此，本课题通过建立大鼠ICH 模型，应用立体定向NS/PCs移植，分别采用CPDT激活及RNAi 技术抑制Nrf2，从正反两反面，综合应用凝胶电泳迁移率实验、RT-PCR、Western blot、流式细胞仪、免疫荧光激光共聚焦显微镜等研究方法，探索Nrf2/PPARγ通路对ICH后小胶质细胞活化所诱导的神经炎症和氧化应激损伤的阻滞调控功能，阐明其对移植的NS/PCs的神经发生能力的保护调控效应与机制。为寻找合适的药物干预ICH 后炎性微环境，以理想的方式调控ICH 后移植的NS/PCs的神经发生模式提供实验依据。

我们的前期研究表明神经炎症是脑出血（ICH）后神经损伤、影响神经再生的主要机制之一，Nrf2/ARE通路在抗炎和抗氧化中起着关键作用，而Nrf2 mRNA是microRNA-27b（miR-27b）的潜在靶点。在本课题中，我们研究了调控miR-27b对ICH后神经损伤的影响；NF-kB激活与ICH后细胞凋亡和病人预后的关系； X线照射导致的神经炎症对于神经干/祖细胞（NS/PCs）神经再生能力的影响；钙池调节性钙内流在高糖诱导的神经损伤中的作用。我们发现大鼠miR-27b水平在ICH后6h开始降低，于1d至最低，Nrf2蛋白水平在12h开始升高，于1d达峰，在2d迅速降至正常，皮尔森相关分析显示ICH后miR-27b与Nrf2蛋白的表达水平呈负相关（r=-0.7782, p<0.001），双荧光素酶实验证实miR-27b能直接结合Nrf2 mRNA 3’非编码区，过表达miR-27b能抑制Nrf2表达，而抑制miR-27b可促进Nrf2表达，脑室内注射miR-27b抑制剂可降低大鼠纹状体内miR-27b水平，减轻ICH所致的脂质过氧化、NF-kB核转位和小胶质细胞活化，减少细胞凋亡；ICH后NF-kB活化和细胞凋亡在脑出血后13-48h最为明显，皮尔森相关分析显示NF-kB活化和细胞凋亡呈线性相关关系（r=0.7578, p<0.0001），多因素逻辑回归分析证实了NF-kB活化是ICH病人发病6个月后不良结局的独立危险因素（AUC=0.893，95%CI 0.787-0.999）；X线照射能促进体内外NS/PCs产生炎性小体，促进caspase-1活化，抑制NS/PCs再生能力，加速其衰老，而使用caspase-1抑制剂可阻断X线照射对NS/PCs的抑制作用；高糖环境能够促进体外海马神经元损伤并上调钙池调节型钙通道，阻断钙池调节型钙内流能够减轻神经元内钙超载，恢复线粒体膜电位，减少细胞色素c释放，抑制细胞凋亡，而使用钙离子螯合剂能通过降低细胞内钙水平减轻高糖诱导的神经元凋亡。通过本项目的研究，我们发现了治疗神经损伤的新靶点和新策略：降低miR-27b水平，改善脑出血后神经损伤；检测血肿周围组织中NF-kB的活化情况来评估ICH病人预后；使用caspase-1抑制剂来提升NS/PCs在神经损伤后的神经再生能力；使用钙离子通道阻滞剂或钙离子螯合剂来治疗糖尿病神经病变。