PPARγ/NF-κB信号通路调控ICH后神经再生促功能恢复的作用机制研究

Our preliminary research has demonstrated that inflammatory microenvironment after ICH encountered by NSCs has an important role on the migration,proliferation and differentiation of stem cells, as well as on the restoration of the neurological deficits of animal models. NF-κB is the key of the immune response and inflammatory reaction, and PPARγ acts as the upstream element,modulats the action of NF-κB, and thus influences the expression of downstream inflammatory genes. According to the establishment of experimental ICH model of SD rats, and the application of multiple researching methods such as EMSA,RT-PCR,Western blot,FCM,histological chemistry and confocal microscopy, the study try to probe the mechanism of how PPARγ to modulate neuroinflammation caused by NF-κB signal pathway, to reveal its effect on NSCs niche, and thus to confirm the effect and mechanism of PPARγ/NF-κB signal pathway modulating the migration, proliferation and differentiation of stem cells. The outcome is helpful to exploit a combination of various drugs, which can perform dual roles in modulating the robust inflammatory attack as well as making an attempt to regulate the neurogenesis pattern in the desired way.

前期研究工作表明ICH后炎性微环境对移植的NSCs的迁移、增殖和分化及动物模型功能恢复具有重要影响。NF-κB在免疫应答和炎症反应中起核心作用，PPARγ为NF-κB的上游因子，调控NF-κB活性，影响下游炎症基因的表达。本课题拟通过建立实验性大鼠ICH模型，分别采用吡格列酮激活及RNAi技术抑制PPARγ，从正反两反面，综合应用凝胶电泳迁移率实验、RT-PCR、Western blot、流式细胞仪、免疫组织化学、免疫荧光激光共聚焦显微镜等多种研究方法，探索PPARγ对NF-κB信号通路介导的神经炎症的免疫因子网络在体内的时间和空间上表达的调控，进一步阐明其对NSCs迁移、增殖和分化在时间和空间上的保护调控效应与机制。为进一步寻找合适的药物等干预措施，以理想的方式调控ICH后神经炎症反应及干细胞的神经发生模式提供理论依据。

本研究探讨PPARγ调控神经炎症的机制，揭示其对炎症微环境中NSCs的作用，从而证实PPARγ调节ICH后移植的NSCs增殖的作用及其机制。吡格列酮等噻唑烷二酮类（TZDs）药物是过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPAR-γ）激动剂，是一种核转录因子，可作为巨噬细胞和小胶质细胞活化的负调节因子。本研究旨在探讨吡格列酮（Pioglitazone，Piog）是否能保护神经干细胞（NSCs）免受脂多糖（LPS）诱导的神经干细胞和小胶质细胞共培养系统炎症微环境的影响。 本研究NSCs分离于鼠脑，体外培养并用免疫荧光分析（IFA）鉴定。 BV2小神经胶质细胞购自美国模式培养物集存库（ATCC）。将BV2小胶质细胞的培养物与用吡格列酮和/或LPS处理的小鼠干细胞NSCs共同培养，并分为4组研究。即：对照，Piog，LPS，LPS + Piog组。进行实时PCR以评估过氧化物酶体增殖物激活受体-γ（PPARγ），肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-6（IL-6）的量。酶联免疫吸附试验（ELISA）用于评估TNF-α和IL-6的量。探讨Piog对LPS诱导炎症微环境中NSCs的保护作用。 对照组（NSCs + BV2），Piog组（NSCs + BV2 + Piog），LPS组（NSCs + BV2 + LPS），LPS + Piog组（NSCs + BV2 + LPS + Piog）4组。使用Transwell渗透支持物来使用NSCs和BV2小神经胶质细胞的共培养系统。使用细胞计数试剂盒-8（CCK8）进行NSCs的增殖测定。 Western Blot检测Bcl-2相关X（Bax）的凋亡蛋白水平。本研究表明吡格列酮能增加PPARγ的表达，抑制LPS诱导的TNF-α，IL-6的表达（P <0.05）。 CCK8实验结果显示Piog促进NSCs增殖和存活（P <0.05）; Western blot结果显示，LPS诱导的炎症微环境下，Piog可以通过降低促凋亡蛋白Bax的表达来保护神经干细胞（P <0.05）。总之，吡格列酮能够抑制LPS诱导的小胶质细胞炎症反应，降低TNF-α和IL-6的表达。同时，吡格列酮可以通过降低Bax的表达来减少炎症微环境诱导的NSCs凋亡。