乳腺癌多药耐药基因治疗研究中靶向性基因转移复合物的优化

细胞膜表面的P-糖蛋白（Pgp）表达增加是乳腺癌多药耐药（MDR）产生的主要原因。在MDR基因治疗实验研究中，基因转导的靶向性和基因表达的特异性是待解决的关键问题。申请者前期构建的含Muc-1启动子（多形上皮粘蛋白-1启动子）的核酶质粒pEGFP-Muc可在乳腺癌细胞中较特异地调控外源目的基因（治疗基因）表达。在此基础上，本研究拟使用噬菌体随机肽库技术，筛选特异性结合Pgp胞外区的结合短肽，用以介导目的基因向乳腺癌耐药细胞靶向性转移。借助新型偶联载体聚乙烯亚胺（PEI），最终建立、优化靶向乳腺癌耐药细胞的基因转移复合物Pgp结合短肽-PEI/核酶质粒。转染荷瘤裸鼠模型，判断其体内介导基因转移的靶向性，并评估其体内逆转MDR效果。预计该基因转移复合物的建立有望在靶细胞识别和目的基因表达两方面均实现靶向性，为乳腺癌MDR基因治疗研究提供有效的靶向性基因导入工具。

本研究主要针对乳腺癌多药耐药（MDR）基因治疗体内实验中，用于基因治疗的基因靶点选择困难、基因转移靶向性差的问题。MDR是肿瘤化疗中经常遇见的现象，往往导致肿瘤化疗失败，由多药耐药基因1（mdr1）编码的P-糖蛋白（Pgp）表达增加是导致MDR产生的主要原因。.脱氧核酸酶是具有催化作用的核酸酶，它以特异性序列结合的方式剪切靶向RNA。然而, 在活体细胞中，选择脱氧核酸酶的有效靶向位点是十分困难的。我们依据目的基因mdr1 mRNA的二级结构进行氧核酸酶靶点的系统筛选，共筛选出MDR1 mRNA表面的12个靶点。再针对这个靶点合成相应的12种脱氧核酸酶后，进一步确定它们对乳腺癌细胞MDR表型的抑制作用。我们证实：筛选出的、针对141位靶点的脱氧核酸酶逆转MDR1表型最有效，并且逆转效果和持续时间均优于反义寡核苷酸和miR-27a抑制剂。.随后，研究中使用噬菌体随机肽库技术，筛选特异性结合Pgp胞外区的结合短肽，用以介导目的基因向乳腺癌耐药细胞靶向性转移。借助新型偶联载体聚乙烯亚胺（PEI），构建了靶向乳腺癌耐药细胞的基因转移复合物Pgp结合短肽-PEI/核酶。细胞实验显示，该Pgp结合短肽/DNA复合物基本没有细胞毒性。与抗Pgp单抗的体外竞争实验显示，耐药细胞表面85.2%的Pgp位点可被该复合物结合，其与Pgp位点的亲和能力可达到抗Pgp单抗的76.5%，说明该复合物在特异性、结合乳腺癌耐药细胞方面已接近抗Pgp单抗的水平。荷瘤裸鼠体内的基因转移靶向性检测显示，种植的瘤体细胞有EGFP的明显表达，而瘤体周围的正常组织无表达。裸鼠的多种脏器中基本未观察到EGFP的表达，说明Pgp结合短肽/DNA复合物在裸鼠体内基因转移方面，所介导的核酶基因主要被导入了瘤体的乳腺癌耐药细胞。荷瘤裸鼠体内MDR逆转实验显示，实验组瘤体细胞出现显著的坏死伴有炎症反应，与对照组相比抑瘤率达到75.5%。同时，裸鼠大多数脏器正常，这说明Pgp结合短肽/DNA复合物在动物体内实验中起到了逆转乳腺癌MDR的作用，并且对正常组织、脏器影响小。.该研究经山东省医药卫生信息研究所检索近5年国内外文献，未发现同类研究（见附件）。研究期间，受本课题资助，共发表SCI论文10篇，其中第一/通讯作者SCI论文3篇，培养研究生4名。