关键microRNAs对人精原干细胞自我更新与分化作用及其调控机理

MicroRNAs (miRNAs) are small and endogenous non-coding single-stranded RNA molecules, and they play crucial roles in regulating cellular proliferation, differentiation, and apoptosis. Spermatogenesis is a special process by which spermatogonial stem cells self-renew and differentiate into male gametes called mature sperm. We and peers have shown that miRNAs are essential for mammalian spermatogenesis. However, it remains unknown about the functions and mechanisms of miRNAs on the self-renewal and differentiation of human spermatogonial stem cells. We have established the methods for isolating human spermatogonial stem cells and other types of male germ cells. Our miRNA microarray revealed that there are distinct expression patterns of human miR-1225-5p, miR-184, miR-30c, let-7a-5p, miR-125b-5p, miR-126-3p between human spermatogonia and spermatocytes. Based upon these findings, we will utilize cell biology, biochemistry, molecular biology approaches to systematically explore the subcellular localization of these miRNAs in human testicular tissues and unveil their functions and the binding targets in controlling the self-renewal and differentiation of human spermatogonial stem cells. Significantly, this project could provide novel RNA regulatory mechanisms in mediating human spermatogenesis and it would offer novel targets for the diagnostics and treatment of male infertility.

miRNAs是一种小的内源性非编码RNA分子，它对细胞的增殖、分化与凋亡有调控作用。精子发生是精原干细胞自我更新与分化为成熟精子的过程。最近研究提示miRNAs在动物的精子发生中起重要作用。然而，miRNAs对人类精原干细胞的自我更新和分化的功能与作用机制尚未报道。我们建立了人类精原干细胞和其他男性生殖细胞的分离方法。我们前期的miRNAs芯片研究发现：人类miR-1225-5p、miR-184、miR-30c、let-7a-5p、miR-125b-5p、miR-126-3p等6种miRNAs在精原细胞与精母细胞的表达差异显著。在此基础上，我们将运用细胞生物学、生物化学、分子生物学等方法,系统研究这些miRNAs在人睾丸组织细胞的表达和它们对人精原干细胞的自我更新与分化的作用及其机理。本项目为理解人类精子发生过程提供新的RNA调控机制，并为男性不育的诊断和治疗提供新的靶标。

miRNAs是一种小的内源性非编码RNA分子，它对细胞的增殖、分化与凋亡有调控作用。精子发生过程包括三个阶段，即精原细胞的有丝分裂、精母细胞的减数分裂、精子形成。最近研究提示miRNAs在动物的精子发生中起重要作用。虽然在啮齿类动物精子发生的分子机制研究已取得了很大的进展，鼠的生精细胞已经用牛血清白蛋白梯度沉降（STA-PUT）重力沉降法得以分离，并且这些细胞的microRNA不同表达谱也已经被鉴定。然而，miRNAs对人类精原干细胞的自我更新和分化的功能与作用机制尚未报道，并且人各阶段的生精细胞还没有被分离。在本研究中，我们用STA-PUT重力沉降法有效地分离出了人精原细胞、粗线期精母细胞、圆形精子细胞。免役荧光化学和减数分裂铺展实验表明，分离的人精原细胞、粗线期精母细胞、圆形精子细胞纯度达90%，细胞活力达98%。运用microRNA芯片分析研究了人精原细胞、粗线期精母细胞、圆形精子细胞的miRNA大规模表达谱。结果显示，32个microRNAs在人精原细胞表达水平高于精母细胞，72个microRNAs在人精原细胞呈低水平表达，表明这些microRNAs与有丝分裂和减数分裂相关。另外，在粗线期精母细胞和圆形精子细胞的比对中，144个microRNAs显示上调趋势而29个microRNAs呈下调趋势，这些结果反映了microRNAs在精子行程中有一定的潜在作用。进一步研究发现，人类miR-1225-5p、miR-184、miR-30c、let-7a-5p、miR-125b-5p、miR-126-3p等6种miRNAs在精原细胞与精母细胞的表达差异显著。运用targetscan、starbase、RNA22、miRtarbase等生物信息学软件预测了一下这些miRNAs的结合靶点，并用real-time PCR实验进一步验证我们的芯片结果。在此基础上，我们将运用细胞生物学、生物化学、分子生物学等方法,系统研究这些miRNAs在人睾丸组织细胞的表达和它们对人精原干细胞的自我更新与分化的作用及其机理。本项目为理解人类精子发生过程提供新的RNA调控机制，并为男性不育的诊断和治疗提供新的靶标。