来源于费氏柠檬酸杆菌植酸酶基因的体外定向分子进化

Phytases catalyze the stepwise hydrolysis of phytate into myoinositol and inorganic phosphate. These enzymes are added to animal diets to improve their phosphorus absorption and to reduce their phosphorus excretion. An 'ideal phytase' should be effective in hydrolyzing phytate in the digestive tract, stable to heat from feed processing and storage, and cheap to produce. Although many phytases gene have been identified, none of them possesses all of these favorable characteristics. One of the most effective strategies to engineering these enzymes is to direct their evolution in vitro. This application will focus on DNA shuffling of phytases from Citrobacter freundii to screen phytases with a set of favorable characteristics. Our study will contribute to better understanding of structure and function of phytase.

植酸酶是一类能够促使植酸磷降解成植酸和无机磷的酶，植物性饲料中添加植酸酶，可以显著改善单胃动物对磷的吸收和减少磷的排放对环境造成的危害。理想中的植酸酶应该具有高比活、耐高温、抗蛋白酶水解等优良的特性，但自然界中存在的植酸酶基本都存在不同的缺陷。体外定向分子进化是解决这一矛盾的有效途径。本申请拟按甲醇酵母的偏爱密码子合成来源于费氏柠檬酸杆菌植酸酶基因，利用基因改组(DNA shuffling)及高通量的突变基因定向筛选技术体系，筛选高比活、耐高温、抗蛋白酶水解的植酸酶，进一步阐明植酸酶的结构和功能的关系，为促进植酸酶在饲料领域的应用提供理论基础。

植酸酶是一类能够促使植酸磷降解成植酸和无机磷的酶，植物性饲料中添加植酸酶，可以显著改善单胃动物对磷的吸收和减少磷的排放对环境造成的危害。理想中的植酸酶应该具有高比活、耐高温、抗蛋白酶水解等优良的特性，但自然界中存在的植酸酶基本都存在不同的缺陷。体外定向分子进化是解决这一矛盾的有效途径。本项目按甲醇酵母的偏爱密码子合成来源于费氏柠檬酸杆菌植酸酶基因，利用基因改组(DNA shuffling)及高通量的突变基因定向筛选技术体系，筛选耐高温、抗蛋白酶水解的植酸酶。通过对3轮突变文库的构建和筛选，筛选获得了突变位点存在差异的5个突变体，突变位点分别为：cfAPPAm19（Q70C，T116N），cfAPPAm56（T116N，K181S，N198G，），cfAPPAm98（K181S，V194C），cfAPPAm127（T116N，A143C，V194C ，N198G），cfAPPAm178（F20E，K181S，N198G）。其中，突变体cfAPPAm127对80℃（处理20 min）的耐受性提高了18%; 突变体cfAPPAm98对胃蛋白酶的耐受性提高了约2倍。通过序列比和三级结构预测，推测T116N、A143C、V194C位点的改变影响了酶的性质。