大豆疫霉孢子囊发育相关G蛋白偶联受体鉴定与作用机理研究

大豆疫霉侵染大豆引起的幼苗猝死和成株期根腐病是世界大豆生产上的主要问题之一，每年给世界大豆产业带来巨额经济损失，而无性繁殖阶段形成孢子囊是大豆疫霉再侵染及病害爆发成灾的中心环节。本项目从生物信息学入手，系统全面地鉴定大豆疫霉全基因组中的G蛋白偶联受体(GPCR)家族，实时定量PCR分析其在不同生长发育阶段的转录表达模式；在此基础上利用我们已经建立的大豆疫霉瞬时转化和稳定转化的基因沉默体系对孢子囊发育阶段上调表达的G蛋白偶联受体进行功能分析；接下来通过膜定位验证以及与G蛋白互作的实验，确认当中真正的G蛋白偶联受体；最后通过分析该基因沉默引起的转录组变化，筛选并鉴定下游关键基因及其功能，从而全面系统地分析G蛋白偶联受体及其介导的信号通路在大豆疫霉孢子囊发育和致病过程中的作用机理，以期为开发阻断孢子囊发育的杀菌剂提供分子靶标。

利用生物信息学分析比对,在大豆疫霉全基因组中共挖掘出59个疑是G蛋白偶联受体（GPCR）家族的编码基因。为了更进一步的了解及预测这些G蛋白偶联受体候选编码基因可能具有的功能，分析了大豆疫霉GPCR候选编码基因转录表达谱，通过RNA-sequencing 转录谱分析，不同G蛋白偶联受体编码基因具有不同的转录模式，结果暗示GPCR蛋白家族参与了疫霉整个生长发育阶段及侵染阶段。利用瞬时转化系统，对大豆疫霉中的G蛋白偶联受体基因编码家族进行功能分析，结果表明编号PsGRK4（129854）和PsGRK8（132410）的沉默转化子表型发生变化。进一步将这2个基因构建到大豆疫霉稳定沉默转化载体上，分别获得2个基因的稳定沉默转化子。表型验证表明PsGRK4沉默突变体游动孢子的游动速率变慢，并且很快休止，导致游动孢子的趋化性丧失；休止孢的萌发显著降低，导致游动孢子的致病性减弱； PsGRK8沉默突变体孢子囊发育受到明显的抑制，形成很少且畸形的孢子囊，孢子囊内的原生质体不能正常割裂成游动孢子并释放，且菌丝体致病性减弱。利用RNA-sequencing解析PsGRK8参与调控孢子囊发育的下游基因，结果表明去乙酰基转移酶编码基因PsHDC1受到PsGRK8的调控并参与了孢子囊发育，PsHDC1沉默突变体孢子囊发育不完全，形成很少且畸形的孢子囊，且该基因的沉默转化子中，调控疫霉孢子囊发育的PsCDC14编码基因的转录显著下降，将PsHDC1构建到含有绿色荧光蛋白的载体上，结果表明PsHDC1定位在细胞核中。为了更进一步了解乙酰基化在基因转录调控中的作用，我们对具有相反功能的乙酰基转移酶PsGCN5编码基因进行了功能分析，结果表明该基因参与了清除植物活性氧的过程，且沉默突变体的致病性减弱，但对孢子囊的发育并没有影响。通过项目的实施，实验结果表明G蛋白偶联受体蛋白PsGRK8通过感受外界环境的变化，进而将信号传导到细胞内，调控去乙酰基转移酶PsHDC1的转录，进而调控细胞循环调控基因PsCdc14，从而调控孢子囊的发育。.在完成项目任务的基础上，在前期生物信息学研究中，发现了一个在疫霉种非常保守，而和其它真菌及腐霉存在差异的YKT6编码基因，以此开发出了疫霉属及大豆疫霉的特异性检测引物。同时，利用新型的LAMP可视化检测技术，以YPT1基因作为检测靶标，建立了大豆疫霉快速、便捷的检测方法。