狂犬病病毒粒子的蛋白质组学研究

The rabies virus (RABV) has less genetic material and RABV replication mainly depends on host cell machinery for energy. The proliferation of the RABV in the host cell is the virus-host cell interaction and regulation. The results in our previous research showed that many host protein joined the process and integrated into the RABV virion during invading, reproduction, package and budding stage. On behalf of this background, this experiment focused on the RABV virion released from the host cell infected with RABV. Firstly, the mature RABV virion was purified with deferential centrifugation and sucrose gradient centrifugation. Then the virion was proceeded with proteomics analysis through lyqiud chromatogram and mass spectrum tandem method. To screen the special host protein, immunogold labeling, western blot and confocal laser technology were used to obtain the host protein and the location of the host protein in the RABV virion. At last RNA interference, the expression of cell line, confocal laser technology, the coprecipitation of immunity and Real - time PCR technology were used to explore the key role of the host protein in the life cycle of RABV. It will be helpful to reveal the pathogenic mechanism of RABV.

狂犬病病毒（Rabies virus，RABV）拥有少量遗传物质，病毒生命周期的完成依赖于宿主细胞的生命维持系统，病毒在细胞内增殖的每一个过程都是病毒与宿主蛋白相互作用、相互调节的结果。研究发现，在病毒的入侵、复制、组装及出芽阶段，许多宿主蛋白参与了这些过程后能够整合到成熟病毒粒子上。为此，本研究从病毒感染后释放的病毒粒子入手，首先利用差速离心法和蔗糖梯度离心法纯化RABV体内和体外感染后释放的成熟病毒粒子。然后采用液相色谱与质谱串联的方法对纯化的病毒粒子进行蛋白质组学分析。为了进一步筛选特异性的宿主蛋白，我们将采用免疫金标、免疫印迹和激光共聚焦技术确定参与病毒生命周期的宿主蛋白、及宿主蛋白在病毒粒子上的定位。最后通过RNA干扰、表达细胞系构建、激光共聚焦技术、免疫共沉淀及Real-time PCR技术，研究宿主蛋白在RABV生命周期中的作用，本研究对揭示RABV致病机制具有重要科学意义。

狂犬病病毒是一种有囊膜的不分节段的负链RNA病毒，主要侵害中枢神经系统，引起人和哺乳动物致命性的脑脊髓炎。现有研究表明囊膜病毒粒子从感染的细胞中出芽释放时会携带许多可能在病毒的复制过程中发挥重要作用的宿主蛋白。尽管先前偶见报道某个宿主蛋白可掺入到狂犬病病毒粒子上，但还没有系统地鉴定狂犬病病毒粒子上的蛋白质组。本研究采用N2a细胞体外培养狂犬病毒CVS-11株，然后利用碘克砂醇（iodixanol）密度梯度超速离心法纯化成熟的狂犬病毒粒子，再采用蛋白质组学方法LC-MS/MS鉴定了成熟的狂犬病病毒粒子上的蛋白质组成。结果表明在纯化的病毒粒子上除检测到狂犬病病毒编码的五个结构蛋白以外，还检测到了102个宿主蛋白。GO注释的蛋白质按生物学过程可分为22类：主要涉及到蛋白质代谢（34%），蛋白质定位（20%），蛋白质运输（13%），生物合成过程（13%），这说明了病毒在宿主细胞中的合成需要多种宿主蛋白的参与。按细胞定位可将其分成20类：但是绝大多数蛋白是囊泡相关蛋白和细胞黏附接头蛋白。KEGG分析结果表明参与胞吞机制信号通路的蛋白质较多，且大多数与ESCRT系统有关，这说明囊泡蛋白可能参与了病毒的出芽、释放。利用免疫印迹和免疫金标记方法对病毒粒子上的11个宿主蛋白进行进一步验证，结果表明宿主蛋白HSC70，TSG101，ALIX，VPS37，CHMP4B，CHMP2B，CHMP3，VPS4B，HSP40确实整合到病毒粒子上，且定位在病毒囊膜的内部，而CD9，β-Actin定位在病毒囊膜的表面。本研究系统地鉴定狂犬病病毒粒子上的宿主蛋白组成，有助于进一步研究该病毒复制与感染机制。