EP0蛋白在伪狂犬病毒粒子中的定位及其与病毒粒子中其它蛋白的相互作用研究

EP0蛋白是PRV早期基因的产物，主要发挥转录激活功能，激活病毒其它基因的表达，这种功能性的蛋白为何会包装进成熟的病毒粒子中？它定位于病毒粒子的何种部位？这种定位有何功能？这些目前都不清楚。对EP0结构域的研究表明，该蛋白中存在与锌指结构类似的环指结构域，是结合DNA、RNA及蛋白质-蛋白质相互作用的区域，但实际上EP0并不结合DNA、RNA，因此它可能在蛋白质-蛋白质相互作用方面具有重要作用。以前的研究表明，EP0至少可与6种宿主细胞核蛋白发生相互作用,但EP0蛋白与PRV病毒粒子中其它蛋白是否存在相互作用尚未见报道。本研究拟通过免疫电镜观察及Western-blot研究EP0蛋白在PRV病毒粒子中的定位；通过pull-down试验找出与EP0可能存在相互作用的蛋白；通过免疫共沉淀试验验证EP0与这些蛋白的相互作用。研究结果对阐明EP0蛋白在病毒粒子中的功能具有重要意义。

EP0蛋白是PRV早期基因的产物，主要发挥转录激活功能，激活病毒其它基因的表达。现有研究表明，该蛋白存在于成熟的病毒粒子中，但它定位于病毒粒子的何种部位？它与病毒粒子中其他蛋白是否存在相互作用？这些都不清楚。为了研究PRV EP0蛋白在病毒粒子中的定位，本研究在大肠杆菌中表达了该蛋白，通过杂交瘤技术成功制备了针对该蛋白的单克隆抗体，确定了该抗体识别的抗原肽及评价了其与天然蛋白的反应性，结果显示该抗体与病毒感染细胞中的天然蛋白反应，与纯化的病毒粒子中的EP0蛋白不反应；基于上述原因，我们制备了抗PRV EP0蛋白的多克隆抗体，用该抗体与胰酶处理的病毒粒子进行孵育，通过Western-blot检测其反应性，结果表明该抗体与未处理的病毒粒子反应，而与胰酶处理的病毒粒子不反应，因此确定PRV EP0蛋白可能位于病毒粒子的囊膜表面，但该结果与前人研究结果不一致，仍需进一步确证。为了研究PRV EP0蛋白与病毒粒子蛋白的相互作用，将EP0与GST在大肠杆菌中进行融合表达，采用谷胱甘肽琼脂糖珠纯化GST-EP0融合蛋白，然后与Triton X-100处理的病毒粒子蛋白进行作用，通过GST Pull-down实验筛选到3种可能与EP0存在相互作用的病毒粒子蛋白，经生物质谱鉴定这3种蛋白分别是PRV VP5，VP13/14，EP0蛋白。用Protein A+G Agarose结合EP0蛋白单抗，然后与PRV感染不同时期的细胞总蛋白进行孵育，通过免疫共沉淀（Co-IP）确定EP0可结合PRV VP5，VP13/14。为了进一步验证其是否存在直接的相互作用，将纯化的PRV病毒粒子经SDS-PAGE电泳后，通过Far wesren blot检测发现EP0可与PRV VP5，VP13/14及EP0蛋白本身发生结合，表明它们之间确实存在相互作用。