早期生长反应因子对肥大细胞诱导的CD4+T细胞迁移活化的信号转导机制研究

Early growth response factor 1 and 2 play important roles in FcεRI-mediated mast cell activation and immune productions. Early growth response factor 2 can significantly affect mast cell induced CD4+T cell migration. Therefore, the purpose of this proposal is to investigate the role of early growth response factor in mast cell derived immune effectors, and the role of early growth response factor family in the regulatory mechanisms of CD4+T cell migration and activation. Firstly, use gene chip or protein chip to screen immune effectors that were regulated by early growth response factor genes. Secondly, use the electrophoresis mobility shift assay (EMSA) or chromatin immunoprecipitation assay (CHIP)to confirm the regulatory mechanisms for early growth response factor gene's target immune effectors. Thirdly, use T cell transwell migration assays, cell activation or proliferation model in vitro to study the regulatory mechanisms of mast cell induced CD4+T cell migration and activation regulated by early growth factor genes. Fourthly, use RNA interference technique to construct Egr-1 and Egr-2 joint deficiency mast cell model, and then investigate whether or not Egr-1 and Egr-2 play a synergetic role in mast cell induced CD4+ T cell migration and activation. Finally, use gene chip and protein chip techniques to investigate the complete signaling pathways in mast cell induced CD4+ T cell migration and activation. Strive to find some new regulatory immune effectors in the process of mast cell induced CD4+ T cell migration and activation. This study will contribute to demonstrate the mechanism of immune response, and prevention or interference with the development and prognosis of hypersensitivity diseases.

早期生长反应因子1和2（Egr-1和2）对FcεRI介导的肥大细胞活化和免疫效应分子产生具有重要的调控作用；Egr-2能明显影响肥大细胞诱导的CD4+T细胞迁移。因此，探索早期生长反应因子对肥大细胞免疫效应分子的影响，以及Egr家族对CD4+T细胞迁移活化的调控机制，是本课题的研究目的。首先，应用芯片技术筛选受Egr基因调控的免疫效应分子；第二，用EMSA、CHIP等方法研究Egr基因对目的免疫效应分子的调控机制；第三，应用体外T细胞迁移、活化增殖模型，研究早期生长反应因子对CD4+T细胞迁移、活化增殖的调控机制；第四，应用RNAi干扰等方法构建Egr-1，2联合缺失肥大细胞模型，研究二者是否在CD4+T细胞迁移或活化等方面具有协同互补作用；第五，应用芯片技术等方法研究肥大细胞诱导CD4+T细胞迁移活化的完整信号途径。力争发现新的免疫调控分子，以阐释免疫应答机制和干预过敏性疾病的发生。

【背景】I型超敏反应是一种常见病，而肥大细胞是I型超敏反应发生的重要免疫效应细胞。前期研究表明，早期生长反应因子（Egr）1和2是肥大细胞FcεRI和c-Kit受体介导的免疫应答的重要转录因子。本课题聚焦于研究Egr家族对肥大细胞活化和诱导CD4+T细胞迁移的调控机制。【内容】应用蛋白质芯片技术筛选受FcεRI受体调控的效应分子；应用CRISPR/Cas9等技术构建Egr基因缺陷模型；研究肥大细胞对T细胞、巨噬细胞迁移的影响等内容。【结果】蛋白质芯片研究表明IgE-FcεRI通路激活的肥大细胞能诱导诱导20余种效应分子的表达，其中CCL1、CCL2、IL-4、IL-13等10余种显著上升。以Transwell为研究模型，发现10、1和0.1ug/ml的抗原DNP-BSA活化肥大细胞的培养上清均能诱导T细胞的迁移。应用抗体预处理培养上清后均能在一定程度上阻止T细胞的迁移，但以抗CCL-1、CCL-2抗体的阻断作用更为明显。应用SCF（50ng/ml）分别刺激肥大细胞1h、3h、6h、12h，发现刺激1h后的培养上清即能诱导T细胞和巨噬细胞的迁移，以3h的培养上清效果较佳。Egr-1和2联合基因缺陷模型的构建是研究Egr基因调控肥大细胞活化和诱导T细胞迁移的核心环节。我们多次尝试siRNA、CRISPR/Cas9等技术构建Egr-1和2联合基因缺陷肥大细胞模型，但因原代肥大细胞的转染效率、存活率和扩增效率等问题，构建Egr联合基因缺陷模型未获成功，对研究Egr基因调控肥大细胞活化和T细胞迁移的作用机制产生了巨大的影响。尽管研究表明：IgE-FcεRI-Egr信号链参与了TNF、IL-13、CCL-1和CCL-2等众多免疫效应因子的调控，并影响了T细胞和巨噬细胞的迁移。但由于Egr-1和2联合基因缺陷构建的失败，我们尚未获得Egr家族对T细胞、巨噬细胞迁移调控的直接证据，深感遗憾！【应用】借助自然基金支持构建的免疫-过敏反应研究平台，我们开展了食品药品分析监测方法的研究，研究表明中药红花注射液中存在潜在的过敏蛋白成分，正深入研究鉴定，以构建识别过敏原、监测产品过敏成分、降低过敏反应发生的方法。另外我们发明了一种可在3分钟内快速染色识别肥大细胞的方法，目前专利申请已进入实质审核。