I型超敏反应中Egr-2对肥大细胞信号转导的调控机制研究

I型超敏反应的发生与肥大细胞功能密切相关。前期工作中以肥大细胞作为过敏反应研究模型发现：早期生长反应因子-1（Egr-1）对FcεRI和c-Kit介导的肥大细胞活化，以及TNFα、IL-13等免疫效应分子的产生具有重要调控作用，并发现伴有Egr-2的激活。本研究旨在探索Egr-2对肥大细胞的调控机制和Egr家族在过敏反应中的作用。主要研究内容如下：1. 以肥大细胞过敏反应模型作为研究对象，用实时定量PCR、FACS、免疫荧光法检测Egr-2mRNA和蛋白质表达；2. 采用siRNA干扰阻断Egr-2的表达，探讨该基因对肥大细胞产生细胞因子、化学因子的调控作用。采用CHIP的方法，检测Egr-2调控的靶基因；3. 构建Egr-1，2双基因缺失模型，深入探讨过敏反应中，Egr家族成员对肥大细胞激活、扩增以及功能发挥的关键信号调控机制。探寻通过调控与Egr相关的分子，以防控过敏反应的发生发展。

前期肥大细胞体外过敏反应试验研究发现：早期生长反应因子-1（Egr-1）对FcεRI和c-Kit介导的肥大细胞活化和免疫效应分子的产生具有重要的调控作用，能调控TNFα、IL-13的表达，同时发现Egr-1激活的过程中伴有Egr-2的活化。探索Egr-2对肥大细胞的调控机制，以及Egr家族在过敏反应中的作用，是本课题的研究目的。.我们应用小鼠MC-9肥大细胞系和小鼠骨髓来源的原代培养肥大细胞（BMMC）研究Egr-2在肥大细胞中的信号转导机制。EMSA结果显示MC-9细胞中存在Egr的表达，免疫荧光结果表明MC-9细胞中同时存在Egr-1和Egr-2的表达。应用Egr-1、Egr-2siRNA干扰的方法构建Egr-1、Egr-2单独缺陷，及Egr-1和Egr-2联合缺陷肥大细胞研究模型，但结果表明siRNA干扰的方法只能部分下调Egr-1、或Egr-2的表达，联合干扰的作用稍强一些。siRNA干扰后，用蛋白质芯片方法研究Egr基因对MC-9细胞的影响。结果表明对Egr基因进行siRNA干扰后，并不能显著影响MC-9细胞炎性因子的表达，这可能与siRNA干扰方法的局限性有关。最近，我们构建了Egr-2 knockout小鼠体外培养肥大细胞研究模型，以继续研究这些尚未达成的目标。.我们研究了BMMC和MC-9细胞中Toll样受体的表达。PCR结果表明BMMC和MC-9细胞中除了表达已知的TLR1～9之外，还首次发现TLR11～13的表达，流式细胞仪和免疫荧光的结果也证实了BMMC和MC-9细胞均表达TLR11～13。.为了解决中药注射剂存在的过敏反应难题，将建立的过敏反应研究平台应用于红花注射液过敏反应研究中。建立了3株针对红花花粉蛋白的单克隆抗体，分别命名为1B6、2A11、6H11。经鉴定，三株单克隆抗体均能识别红花花粉蛋白。用1B6检测不同企业生产的红花制剂，结果显示1B6能检测红花花粉蛋白残留，表明该单克隆抗体可用于红花注射液过敏原残留筛查。Western Boltting结果显示， 1B6能识别花粉提取物中约40、29和20KD的三个条带。目前，我们正在解析三条蛋白条带结构，希望能厘清红花注射液中存在的过敏原，为研制能用于红花注射液过敏原筛查的竞争性ELISA试剂盒，为企业改进红花注射液制备工艺、确保质量控制提供有效的方法。