鳗弧菌感染前后大菱鲆肠道黏膜免疫相关基因的鉴定与功能解析

The mucosal surfaces of fish are the first sites for bacteria attachment and entry, and serving as the first line of host defense. It has long been hypothesized that the observed differences in disease susceptibility between fish species and strains are due to the differing ability of the host to prevent pathogen attachment and entry at mucosal epithelial surfaces. Through vaccination, especially the mucosal vaccine to improve the disease resistance of the fish mucosal surfaces is the best way to control and prevent the fish disease. But at present, only injection can induce the best immune effect for most of the aquatic vaccine, the immune effect of mucosal vaccine is weak and difficult to lasting. In this regard, turbot (Scophthalmus maximus), one of the dominate mariculture species in China will be selected, and our research will focus on Vibrio anguillarum and its primary infection tissue, intestine. First, we will utilize histopathology, immunohistochemistry and molecular biology methods to determine the early important timepoints (adhesion, entry and replication) of V. anguillarum infection, then screen the intestinal immune related genes of Turbot by high throughput sequencing, identify the key intestinal mucosal immune genes, and using in vivo and in vitro gene function deletion experiments to characterize their immune regulation function. Our results will set the foundation for explaining the mechanisms of mucosal immune response in Turbot, provide gene resources for selection of resistant turbot brood stocks and development of aquatic mucosal vaccine, and provide new research ideas and theoretical support for expanding our understanding of the mucosal immunity of vertebrate.

鱼类黏膜表面是病原体吸附和入侵的第一点，是免疫防御的第一道防线。长期以来，人们一直假设不同个体和家系所表现出的不同抗病性与黏膜表面阻止病原体吸附和入侵的能力具有直接关系。通过免疫手段，尤其是最适于鱼类的黏膜疫苗来提高黏膜表面的免疫抵抗力，是鱼类病害免疫防治的最佳手段之一。但是当前绝大多数水产疫苗只有通过注射才能获得最佳效果，黏膜疫苗免疫效果弱且难以持久。因此，本项目拟以我国海水养殖重要鱼类之一的大菱鲆为研究对象，聚焦于鳗弧菌和其首要侵染组织肠道，首先明确鳗弧菌吸附、入侵和定植肠道的关键时间点，然后高通量的筛选大菱鲆肠道黏膜差异表达基因，鉴定关键肠道黏膜免疫基因，并通过体内和体外基因功能缺失实验明确其免疫调控功能。本项目研究结果可为阐明大菱鲆黏膜免疫调控机制奠定理论基础，也为大菱鲆后续分子抗病选育和黏膜疫苗研发提供可靠的基因资源，并为进一步丰富鱼类黏膜免疫研究内容提供新的研究思路和理论支持。

肠道是黏膜防疫防御的重要器官，在生活在水环境的鱼类中发挥着尤为重要的作用。本项目以我国海水养殖重要鱼类之一的大菱鲆为研究对象，聚焦于鳗弧菌和其首要侵染组织肠道，对肠道黏膜与鳗弧菌的免疫应答机制展开系统深入的研究，高通量的筛选和鉴定大菱鲆肠道黏膜免疫基因，了解其免疫调控和表达分布模式，鉴定关键基因在黏膜免疫屏障中的免疫调控作用。通过本项目的实施，对鳗弧菌浸泡感染后的大菱鲆进行了病理分析，明确了感染过程中的组织变化规律，并利用实时荧光定量的方法检测感染前后的组织病原菌分布。根据鳗弧菌分布结果，选取了1h，4h和12h四个关键时间点的肠道组织进行转录组测序分析。构建了大菱鲆肠道表达谱，总共122,000,000条150bp的短序列组装成183,101条平均长度为1,151bp以及N50长度为2,302bp的长序列contig。对照组与感染后1h、4h和12h时处理组之间的基因表达分析鉴定了2079个显著性表达基因，差异表达基因的富集和通路分析显示病原菌附着和识别、抗氧化和细胞凋亡、黏膜屏障修饰以及免疫活性和炎症反应等信号通路在抗菌应答中发挥重要作用。通过基因注释，功能富集分析，筛选到多个关键肠道黏膜免疫基因。进一步对关键肠道黏膜免疫基因的体内组织表达分布规律、感染后各组织表达变化规律进行了深入探讨。结果表明，关键基因在肠道中均具有较高的本底表达水平，并在不同病原菌感染前后的肠道中具有极为显著的表达调控变化。体内和体外干扰试验表明清道夫受体B1（SCARB1）和整合素β4（itgb4）在大菱鲆肠道中具有显著的免疫调节作用。相关研究结果已发表第一标注SCI论文6篇，培养研究生2名，参加学术会议2次，项目负责人入选2019 年度山东省泰山学者青年专家支持计划。本项目研究结果丰富了鱼类黏膜免疫研究内容，为下一步深层次免疫理论研究和病害免疫防治实践奠定了初步基础。