鳗弧菌多胺转运系统中亚精胺结合蛋白基因的鉴定及其功能研究

鳗弧菌是鱼类弧菌病的重要病原，以往的研究多集中于传统意义上的毒力因子。多胺对人的某些病原的致病性、存活力和毒力有重要作用。亚精胺结合蛋白PotD是细菌多胺转运系统中的底物结合蛋白，与人的某些病原菌的毒力、存活力密切相关。项目组在鳗弧菌中发现了3个推定的potD，本项目将①构建推定的potD的缺失突变株和互补株, 利用毛细管电泳-激光诱发荧光技术测定在多胺合成抑制剂存在时野生株、突变株和互补株胞内多胺的含量，用以鉴定potD；②利用定量PCR比较鳗弧菌在正常培养、体内感染过程中potD表达量的差异，并比较野生株和突变株对鱼的半数致死量及在体内存活数量，以确定potD与毒力、存活力的关系；③考察重组表达的PotD对鱼的免疫保护能力。本项目首次研究鱼的病原菌中亚精胺结合蛋白的基因和功能，有望揭示鳗弧菌中多胺和毒力的关系，从而从新的角度来理解鳗弧菌的致病机理，并提高对鳗弧菌病的防治措施。

鳗弧菌是鱼类弧菌病的重要病原，以往的研究多集中于传统意义上的毒力因子。多胺对人的某些病原的存活力和毒力有重要作用。亚精胺结合蛋白PotD是细菌多胺转运系统中的底物结合蛋白，与人的某些病原菌的毒力、存活力密切相关。但在鱼的病原中尚没有相关研究。项目组在鳗弧菌中发现了3个推定的potD基因，利用框内缺失技术构建了推定的potD的缺失突变株和互补株。 利用HPLC测定了多胺在野生株、突变株和互补株胞内多胺的含量，发现potD1，potD3对胞内亚精胺含量有显著的影响，potD2对胞内亚精胺含量没有影响。potD1,potD3对胞内腐胺及精胺也都有较大影响。利用缺失突变株攻毒蓝曼龙，根据蓝曼龙的死亡数量计算半数致死量，发现potD1,potD3的缺失均使M3的毒力显著下降，而potD2对鳗弧菌毒力没有影响。为了研究毒力下降原因，课题组在攻毒后的不同时间取鱼的肝脏进行细菌平板涂布计数。结果发现potD1突变株和potD3突变株在鱼体内的数量比野生株和potD2突变株少，表明多胺转运系统的缺失影响了突变株在体内的存活能力。课题组还比较了野生株和突变株在不同培养基中的生长曲线，结果表明野生株在TSB培养基和M9培养基中和突变株生长没有区别，而在M9+多胺的培养基中，potD1 突变株和potD3突变株的生长均受到不同程度的影响，potD2的突变株与野生株没有显著差别，表明potD2 与多胺的转运没有关系，并且多胺影响细菌的生长。利用定量PCR我们比较了potD1,potD2,potD3在体外培养和感染鱼后的鳗弧菌中的表达量，结果发现在鱼体内，potD1的表达量是potD2的2.7倍，potD3的表达量是potD2 的13.6倍。potD2在鱼体内和体外培养时表达量没有明显差异，而potD1和potD3在鱼体内的表达量均有上升，其中potD1在鱼体内的表达量是体外的200倍。课题组还比较了野生株和突变株的泳动能力，发现与野生株相比，突变株的泳动能力均有所下降。利用大肠杆菌重组表达potD1和potD3基因，并用纯化的蛋白免疫鱼，攻毒后发现PotD1 蛋白对大菱鲆的免疫保护率为26.7%，PotD3 蛋白对大菱鲆的免疫保护率为36.7%。本研究表明，potD1和potd3与鳗弧菌的多胺转运相关，从而影响了鳗弧菌在体外的生长能力以及在鱼体内的毒力、存活力和泳动能力。