组织工程联合反义核酸技术重建尿道的实验研究

口腔黏膜是目前国内外应用最广的尿道重建材料，但存在供区损伤大，组织来源有限等缺点。应用干细胞组织工程技术进行尿道重建是当前研究的热点之一，但因其调控、诱导困难，短期内尚无法应用于临床，且其亦无法避免修复段尿道瘢痕的生成。针对上述问题，本项目拟联合应用组织工程和反义核酸技术，以口腔黏膜细胞和成纤维细胞为种子细胞，以膀胱黏膜下层脱细胞基质（BAMG）为支架，构建更接近生理结构的组织工程口腔黏膜；并在此基础上，将反义转化生长因子-β1（TGF-β1）寡核苷酸在脂质体介导下转染成纤维细胞，减少其I型胶原的过度合成与分泌，使重建的组织工程尿道既具有促进愈合的能力，又具备抑制瘢痕形成的能力，以期探寻尿道重建的新策略，降低尿道狭窄的复发率。

本研究致力于联合应用组织工程和RNA干扰技术，进行尿道重建的探索。课题组成功制备了兔膀胱黏膜下层脱细胞基质，显示其呈疏松的薄膜状，随机取材HE染色，光镜观察筋膜为疏松的胶原成分，未见有细胞存在，脱细胞效果良好，可作为尿道重建的支架材料。课题组成功进行了兔口腔黏膜细胞和成纤维细胞的培养和鉴定，研究结果显示口腔黏膜细胞可传代至7－8代，呈现典型的“铺路石”状，细胞大小均一；传至第2代，细胞总量可达到8.01×106，此细胞数量可满足组织工程技术需要。成纤维细胞培养生长良好，呈梭形，约3天左右传代一次。根据Genbank中TGF-β1基因序列,设计3对TGF-β1-siRNA序列, 分别转染兔成纤维细胞，通过Q-PCR，筛选出干扰效果最佳的siRNA。把干扰效果最佳的siRNA，重新转染兔成纤维细胞，行ELISA检测观察I型胶原蛋白变化情况。研究结果显示siRNA可通过干扰TGF-β1的表达抑制成纤维细胞I型胶原蛋白的分泌，从而抑制瘢痕生成，为尿道瘢痕的基因治疗提供了理论依据。然后课题组以口腔黏膜细胞和转染后成纤维细胞为种子细胞，以膀胱黏膜下层脱细胞基质为支架，构建出更接近生理结构的组织工程口腔黏膜，通过 HE染色、扫描电镜对所构建的组织进行评价，结果显示口腔黏膜细胞和转染后成纤维细胞在支架上生长良好，复合效果良好。我们应用此组织工程材料来进行尿道重建并设立对照组进行研究对比。研究结果显示联合应用口腔黏膜细胞和siRNA转染的成纤维细胞进行尿道重建，尿道管腔通畅，瘢痕生成明显减少，修复处毛细血管生成明显增多，修复效果明显优于对照组。现中文论著《TGF-β1表达对成纤维细胞胶原分泌影响的实验研究》已在《现代泌尿外科杂志》2012年9月发表；英文论著《Preliminary experimental study of urethral reconstruction with tissue engineering and RNA interference techniques》投稿《Asian Journal of Andrology》（IF：1.521），已接受；英文论著《Urethral reconstruction with tissue engineering and RNA interference techniques》投稿《UROLOGY》，修稿中，待发表。